Ciências Biológicas e da Saúde
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Item Análise genômica de Serratia liquefaciens isolada de leite e inibição da proteólise e lipólise por nisina(Universidade Federal de Viçosa, 2023-05-12) Ribeiro, Leandro Cardoso; Vanetti, Maria Cristina Dantas; http://lattes.cnpq.br/6601616143350350Serratia é um gênero de bactérias Gram-negativas que pode ser encontrado em diversos ambientes como solo, água, plantas, animais e humanos. Algumas espécies são relatadas como contaminantes de alimentos, sendo associadas à deterioração de produtos alimentícios, resultando em prejuízos econômicos e ambientais devido ao desperdício. A espécie S. liquefaciens é frequentemente mencionada como deterioradora de alimentos refrigerados, como frutos do mar, queijos e leite cru. É considerada um problema para a indústria de alimentos devido à síntese de enzimas extracelulares termorresistentes, como proteases e lipases, que permanecem ativas mesmo após o processamento térmico. Estudos prévios mostraram o efeito inibidor da bacteriocina nisina sobre a atividade de proteases e lipases de S. liquefaciens. Nisina é um peptídeo catiônico com amplo espectro de ação contra bactérias Gram-positivas, e seu uso como conservante de alimentos é permitido desde 1950. Este trabalho objetivou investigar as características moleculares de S. liquefaciens L211 isolada de leite, por meio de análises genômicas utilizando ferramentas de bioinformática e avaliar o efeito da nisina nas atividades proteolítica e lipolítica da bactéria em questão. Para isso, foi realizado o sequenciamento do genoma de S. liquefaciens L211 utilizando a plataforma MinION. Em seguida a montagem e anotação do genoma foram realizadas, destacando as características funcionais dos genes da bactéria. Foram realizadas análises comparativas do genoma do isolado L211 com outros genomas S. liquefaciens, completos e anotados, disponíveis no banco de dados do NCBI. Análises fenotípicas evidenciaram que o S. liquefaciens L211 possui a capacidade de se locomover, utilizando os motilidades do tipo swarming, swimming e twitching. Além disso, foi constatada a capacidade de síntese de sideróforos, proteases e poliuretanase com atividade de lipase no isolado. As atividades proteolítica e lipolítica de S. liquefaciens L211 foram avaliadas e quantificadas em leite desnatado reconstituído à 10% (p/v) com e sem a adição de nisina (400 UA/mL) para verificar o efeito inibitório de nisina sobre a atividade enzimática. Posteriormente, foi avaliado se a inibição da atividade enzimática por nisina é decorrente da diminuição da expressão dos genes ser1, ser2 e lipA relacionados com a síntese das proteases e lipase de S. liquefaciens. As análises do genoma de S. liquefaciens L211 revelaram que a espécie apresenta características genéticas preservadas, ao passo que as variações entre os indivíduos da espécie S. liquefaciens possibilitam sua adaptação a diferentes ambientes. Além disso, também foi observado que S. liquefaciens possui genes que codificam enzimas associadas à deterioração de alimentos. Foi demonstrado que, apesar de não ter atividade bactericida contra S. liquefaciens, a concentração 400 UA/mL de nisina inibe a atividade proteolítica e lipolítica. Não foram encontradas referências na literatura que relatem a inibição das atividades enzimáticas por nisina em S. liquefaciens. Nisina inibiu a transcrição de genes de proteases e lipase de S. liquefaciens L211 e o mecanismo de regulação envolvido ainda precisa ser elucidado. Este trabalho destaca a versatilidade do repertório genético de S. liquefaciens, a relevância da bactéria como deterioradora de alimentos e revela o potencial inibitório de nisina sobre a atividade enzimática. Palavras-chave: Tese. Pós-graduação. Leite. Microbiologia. Serratia liquefaciens. Bactérias Gram-negativas. Nisina. Proteólise. Lipólise. Genômica.Item Análise in silico e caracterização funcional de RNAs pequenos reguladores: alvos e fenótipos envolvidos em Actinobacillus pleuropneumoniae(Universidade Federal de Viçosa, 2018-09-06) Sanches, Newton Moreno; Bazzolli, Denise Mara Soares; http://lattes.cnpq.br/8446507970942803Actinobacillus pleuropneumoniae (App) é o agente causal da pleuropneumonia suína, doença que causa uma pleuropneumonia fibrinosa, exsudativa, hemorrágica, necrosante, que afeta porcos de todas as idades, levando à morte súbita e grandes perdas econômicas em todo o mundo. Existem dois métodos básicos para limitar a infecção endêmica de App: antibióticos e vacinas, mas a segunda opção não é eficiente para controlar a pleuropneumonia porcina. A virulência de App é complexa e envolve diferentes fatores bacterianos que incluem exotoxinas, polissacarídeos capsulares e lipopolissacarídeos. Além disso, existem fatores adicionais de virulência que são up- ou down-regulados durante a infecção e pequenos RNAs reguladores (sRNAs) podem regulá-los. Recentemente, nosso grupo identificou 23 sRNAs em App, cuja transcrição foi validada por RNA-Seq. Neste trabalho selecionamos seis genes sRNA e produzimos mutantes de deleção a partir dos parentais selvagem (WT_ΔsRNA) e de seu mutante isogênico para a chaperona de sRNAs, Hfq (Δhfq_ΔsRNA). Além disso, propomos uma análise robusta in silico da estrutura, conservação e interação dos RNAs de App com seus alvos. Os fenótipos desses mutantes foram comparados aos da linhagem parental sob diferentes condições, como: curva de crescimento, crescimento sob diferentes condições de estresse, determinação da concentração inibitória mínima contra antibióticos, adesão em superfícies bióticas e abióticas, atividade hemolítica e virulência no modelo alternativo de infecção, Galleria mellonella. As linhagens ΔsRNA exibiram uma diferença fenotípica em relação às linhagens parentais sob pelo menos uma condição, revelando que os sRNAs de App estão envolvidos na regulação da virulência. Notavelmente, alguns mutantes de deleção simples mostraram um fenótipo de ganho de função, que ainda não foi descrito para nenhum outro mutante de deleção de gene de sRNA na família Pasteurellaceae. Além disso, um mutante mostrou uma forte atenuação de virulência, sendo um candidato para elaboração de uma vacina viva atenuada contra A. pleuropneumoniae. As análises in silico revelaram a presença de sRNAs de App em seis gêneros da família Pasteurellaceae. Vários alvos foram encontrados e categorizados em diferentes funções, evidenciando uma complexa rede de regulação gênica para esses RNAs. A partir desses resultados, propomos um modelo de ação via Arrc14 em que ele atua como regulador negativo no metabolismo de amino e nucleotídeo açúcares. Nossos resultados permitem concluir que os sRNAs aqui estudados interferem de forma distinta na regulação da virulência de Actinobacillus pleuropneumoniae sorotipo 8. Concluímos ainda que, com base nos dados obtidos para RNA01, a linhagem WT_Δrna01 possui potencial para ser utilizada no desenvolvimento de uma vacina atenuada viva para prevenir e controlar infecções por Actinobacillus pleuropneumoniae.Item Aplicação de microrganismos lipolíticos em alimentos e na biodegradação de poliuretanos(Universidade Federal de Viçosa, 2023-05-03) Salgado, Cleonice Aparecida; Vanetti, Maria Cristina Dantas; http://lattes.cnpq.br/7129515359990634Os microrganismos são considerados fontes inestimáveis de compostos extracelulares, como enzimas, tornando-os o centro da investigação científica, tanto nos aspectos de biodeterioração em que estão envolvidos, quanto para aplicação biotecnológica. As lipases são enzimas responsáveis principalmente, pela hidrólise dos triacilgliceróis e amplamente exploradas comercialmente. Além da hidrólise, conseguem catalisar a reação reversa, a esterificação e, também reações como transesterificação, interesterificação, acidólise e aminólise. Dese modo, as lipases são reconhecidas como catalisadores promissores no melhoramento da qualidade sensorial de diversos produtos alimentícios além de, biodegradarem diversos substratos. A lipase de Serratia liquefaciens L135 foi identificada como uma poliuretanase, ou seja, uma enzima com a capacidade de biodegradar poliuretanos (PU). Este trabalho foi desenvolvido com o objetivo de explorar o potencial desta enzima na indústria de alimentos e na biodegradação de poliuretanos por S. liquefaciens isoladamente ou em consórcio microbiano. Para isso buscou-se isolar potenciais biodegradadores de PU do intestino de larvas de Galleria mellonella e avaliar o efeito da associação com S. liquefaciens na biodegradação de PU in vitro. O primeiro capítulo apresenta uma revisão de literatura que abrange as aplicações de lipases em indústrias de laticínios; óleos e gorduras; panificação e confeitaria; carnes; sabores e aromas; e outras indústrias alimentícias. Além disso, aborda as técnicas de fermentação de baixo custo e engenharia de proteínas, como promissoras para produção de lipases microbianas. No segundo capítulo são apresentados resultados de estudos in silico e in vitro do potencial biodegradador de PU por S. liquefaciens L135 e sua poliuretanase. Para o estudo in silico, foram construídos monômeros e tetrâmeros de PU para realizar o docking molecular com a poliuretanase modelada e validada de S. liquefaciens. Foi possível verificar que os PU ligaram ao resíduo de aminoácido S207, que faz parte da tríade catalítica e é responsável pela ação hidrolítica da poliuretanase. Os monômeros apresentaram melhores scores de ligações, quando comparados com os tetrâmeros, devido às interações estéricas repulsivas. Os PU, Impranil® e poli[4,4'-metilenobis(fenilisocianato)-alt-1,4- butanodiol/di(propilenoglicol)/policaprolactona] (PCLMDI), foram usados para as análises in vitro. A biodegradação do Impranil® por S. liquefaciens e sua poliuretanase foi confirmada em ágar pela formação de halos transparentes. Além disso, foram preparados discos de Impranil® e filmes de PCLMDI e a biodegradação durante o cultivo de S. liquefaciens foi avaliada por microscopia eletrônica de varredura (MEV). Foi possível averiguar a formação de rachaduras e poros na superfície dos PU, configurando o processo de biodegradação. No terceiro capítulo, foi feito o isolamento da bactéria Staphylococcus warneri do intestino da larva de G. mellonella, com potencial de biodegradação de PU. O isolado S. warneri, denominado de UFV_01.21, foi avaliado em cultura pura e em consórcio com S. liquefaciens L135 para biodegradação de PU e, em ambas condições, o Impranil® foi utilizado como única fonte de carbono. Com seis dias de incubação, suspensões de Impranil® em caldo Luria-Bertani (LB) inoculadas com S. liquefaciens, S. warneri e com consórcio microbiano, apresentaram 88, 96 e 76% de biodegradação, respectivamente. Tanto nos discos de Impranil®, quanto em filmes de PCLMDI, S. warneri em cultura pura e em consórcio com S. liquefaciens foi capaz de aderir e formar biofilmes. Por MEV, foi possível confirmar a biodegradação devido a formação de rachaduras, sulcos, poros e rugosidades nas superfícies dos PU avaliados. Esses resultados reforçam o potencial dos microrganismos e suas enzimas para biodegradação de PU. Palavras-chave: Biocatalisadores. Biodegradação. Consórcio Microbiano. Docking Molecular.Item Assessment of ethanol tolerance of Kluyveromyces marxianus CCT 7735 selected by adaptive laboratory evolution(Universidade Federal de Viçosa, 2018-08-29) Silveira, Fernando Augusto da; Silveira, Wendel Batista da; http://lattes.cnpq.br/4876491797184708Whey is a by-product formed during the cheese-making, which presents lactose (4.5-5% w/v), soluble proteins, lipids, mineral salts and other components. It is the most abundant liquid waste generated in the dairy industries, which can lead to the pollution of water bodies due to its high biochemical oxygen demand and chemical oxygen demand. Whey permeate (WP) is a by-product constituted by lactose, produced from whey ultrafiltration. This way, WP can be converted by lactose-assimilating microorganisms, like yeasts, into value-added products. Kluyveromyces marxianus CCT 7735 has been showing a great potential for producing ethanol from lactose. However, its low ethanol tolerance is a drawback to be overcome, i. e., its growth is highly inhibited from 4% of ethanol (v/v). Adaptive laboratory evolution was used to select ethanol-tolerant K. marxianus CCT 7735 strains (ETSs). ETSs were grown under ethanol stress (4%, v/v) for long periods of time, over many generations (310-340 number of generations), in order to select the ethanol-tolerant phenotypes. From the determination of the physiological parameters, ETSs did not present alterations in their fermentative capacity, when compared their parental strains. However, ETS4 strain stood out for displaying a specific growth rate higher than the parental strain under ethanol stress (above 100%) and a specific ethanol production rate superior to all strains evaluated in this work. The metabolomic and fatty acids analysis were carried out with both ETS4 and parental strains to gain insights into the mechanisms related to the acquisition of ethanol tolerance. The accumulation of some amino acids (glutamate, alanine, valine, proline, and leucine) and metabolites of the citric acid cycle (isocitric acid, citric acid, cis-aconitic acid and malic acid) in ETS4 was found to be associated with the acquisition of ethanol tolerance. Furthermore, high fatty acids content and ergosterol in ETS4 compared to the parental strain indicate differences in their plasma membrane composition, which is consistent with metabolite leakage observed in the parental strain. Therefore, the accumulation of amino acids and citric acid cycle metabolites, as well as the alteration in the fatty acid and ergosterol contents contributed to the acquisition of ethanol tolerance in K. marxianus.Item Assessment of metabolic regulation and stress response in oleaginous yeasts by systems biology approaches(Universidade Federal de Viçosa, 2024-01-30) Almeida, Eduardo Luís Menezes de; Silveira, Wendel Batista da; http://lattes.cnpq.br/3157480507007265The current environmental crises promoted by the extensive use of oil have highlighted the necessity of alternative and sustainable production chains. Lipids and fatty acids from oleaginous yeasts produced from lignocellulosic hydrolysates are promising sources for oleochemicals. Hence, selecting and developing robust yeast strains that can grow and produce lipids in lignocellulosic hydrolysates is pivotal to broaden their applicability and viability. Lipomyces starkeyi is an oleaginous yeast capable of growing and producing lipids using a diverse range of carbon sources. Its growth and lipid production have been demonstrated in lignocellulosic biomasses. Papiliotrema laurentii can also assimilate sugars derived from agricultural wastes, such as glucose and xylose from lignocellulosic biomasses, and convert them into high lipid amounts. However, wild P. laurentii strains are highly sensitive to acetic acid, one of the primary inhibitors in lignocellulosic hydrolysates. The understanding of multifactorial stress responses and yeast physiology can be facilitated by the application of holistic approaches, including biological networks and high-throughput data. Therefore, we hypothesized that the use of systems biology approaches, including genome-scale metabolic models (GEMs) and transcriptomics, as well as their integration, can support us to understand the metabolism and stress responses of oleaginous yeasts and identify suitable targets for metabolic engineering. Herein, we propose the first GEM of L. starkeyi, lista-GEM. We reconstructed lista-GEM using two high-quality oleaginous yeast models as templates and curated it to reflect the metabolism of L. starkeyi. The simulated phenotypes and predicted flux distributions were in good accordance with experimental data. Then, we predicted targets to improve lipid production in glucose, xylose, and glycerol. Enzymes related to lipid synthesis in the endoplasmic reticulum, such as stearoyl-CoA desaturase, fatty-acyl-CoA synthase, diacylglycerol acyltransferase, and glycerol-3-phosphate acyltransferase, were the main targets to improve lipid production. Glycolytic genes were also predicted as targets for overexpression. Pyruvate decarboxylase, acetaldehyde dehydrogenase, acetyl-CoA synthetase, adenylate kinase, inorganic diphosphatase, and triose-phosphate isomerase were predicted only when glycerol was the carbon source. Hence, lista-GEM provides multiple metabolic engineeringtargets to improve lipid production by L. starkeyi using carbon sources from agricultural and industrial wastes. Furthermore, we combined transcriptome and genome-scale metabolic modeling to deepen our understanding regarding the targets of acetic acid stress, as well as the adaptive responses in P. laurentii. Acetic acid stress promoted global expression changes and most repressed genes were related to transcriptional and translational processes. Under stress, the sensitive strain induced DNA mismatch repair mechanisms and meiosis, while the tolerant strain negatively regulated autophagy and the cell cycle. The tolerant strain induced processes responsible for increasing the intracellular pH (e.g., arginase, ornithine metabolism, urea cycle), detoxification of toxic compounds (e.g., glutathione metabolism), and proton efflux. The tolerant strain also presented a remarkable NAD(P)H pool in the metabolic modeling analysis, which might support the reducing power required by tolerance mechanisms. Otherwise, the sensitive strain induced genes related to cell wall biogenesis and cobalamin synthesis. Overall, the genes and pathways described herein as tolerant-related can be useful in future metabolic engineering strategies to improve the tolerance of P. laurentii to weak acids, boosting its application in lignocellulosic-based biorefineries. Keywords: Metabolic modeling; Transcriptomics; Non-Saccharomyces.Item Atividade biológica de Lentinula edodes e produção de shiitake em substrato enriquecido com selênio(Universidade Federal de Viçosa, 2005-03-18) Nunes, Regiane Gonçalves Feitosa Leal; Vanetti, Maria Cristina Dantas; http://lattes.cnpq.br/5848593206305248O enriquecimento do cogumelo shiitake com selênio (Se) pode ser uma alternativa para elevar seu valor nutricional e funcional. O objetivo deste trabalho foi avaliar o efeito do Se sobre o crescimento e atividade biológica do fungo Lentinula edodes e produzir shiitake enriquecido com esse elemento. O crescimento de doze isolados de L. edodes, cultivados em ágar batata dextrose (BDA) e em substrato ligninocelulósico, contendo 0,32; 0,64; 0,96; 1,28 mmol L -1 de selenito de sódio e controle sem Se, variou com o substrato, com o isolado e com a concentração de Se. A matéria seca fúngica da maioria dos isolados cultivados em BDA diminuiu com o aumento da concentração de Se no meio de cultivo. Foram selecionados os isolados UFV11, UFV16 e UFV53, para continuidade do estudo, com base no crescimento da colônia, na biomassa seca e no potencial de produção de cogumelos. Os diâmetros das hifas, as distâncias entre septos e entre núcleos tenderam a diminuir nas maiores concentrações de Se. A atividade da lacase foi crescente com o aumento da dose de selenito de sódio enquanto que as atividades da celulase e xilanase diminuíram. A taxa respiratória acumulada variou com o isolado e foi maior no isolado UFV11. A morfologia e o tamanho dos cogumelos, cultivados em substratos enriquecidos com 0,08; 0,16 e 0,32 mmol L -1 de selenito de sódio, não variaram com a presença de Se e nem entre os isolados. Os valores de L, a e b, referentes à cor dos cogumelos foram menores nos tratamentos com Se quando comparados com o controle. O teor de umidade dos cogumelos variou de 89 a 91 % e aumentou na maior dose de Se. Os valores de proteínas solúveis foram em média 22,3 mg g -1 de matéria seca e não variaram com a presença de Se e nem com o isolado. Os teores de cálcio e de fósforo não variaram com o aumento da concentração de Se enquanto que os de magnésio tenderam a aumentar e os de potássio a diminuir. As concentrações de Se dos cogumelos aumentaram linearmente com o aumento da dose de selenito de sódio, sendo encontrado valores superiores a 17 mg 100 g -1 de cogumelos desidratados no tratamento com 0,64 mmol L -1 de selenito de sódio. Nos cogumelos do tratamento controle não foi detectado Se. A produtividade dos cogumelos aumentou até a concentração 0,32 mmol L -1 de selenito de sódio. O isolado UFV16 foi o que apresentou maior eficiência biológica em doses mais elevadas de Se.Item Avaliação da tecnologia de bacteriófagos em sistemas de fluxo dinâmico (loopings) para controle de biofilmes e bactérias redutoras de sulfato na indústria do petróleo(Universidade Federal de Viçosa, 2023-02-07) Sousa, Maíra Paula de; Paula, Sérgio Oliveira de; http://lattes.cnpq.br/7452116967390776A aplicação da tecnologia de bacteriófagos na indústria do petróleo tem sido considerada uma alternativa promissora para o controle de contaminações microbianas associadas à biocorrosão e à geração biogênica de sulfeto de hidrogênio (H2S). Essas contaminações estão presentes ao longo de toda a cadeia produtiva do petróleo, representando riscos ocupacionais e operacionais. Seu controle se dá principalmente pela aplicação de biocidas que, em geral, apresentam um baixo poder de penetração em biofilmes e, portanto, são pouco eficazes. Isso ocorre devido às substâncias extracelulares produzidas pelos microrganismos, que funcionam como uma barreira de proteção. Nesse contexto, os bacteriófagos podem conferir vantagens sobre os biocidas, uma vez que: podem se multiplicar no ambiente, possibilitando a redução da dosagem; possuem enzimas capazes de romper a matriz dos biofilmes, conferindo poder de penetração e maior eficácia; e, podem apresentar menores impactos ocupacionais, operacionais e ambientais. O presente trabalho teve como objetivos: (i ) avaliar em sistemas de fluxo dinâmico (Loopings) o efeito de coquetéis fágicos sobre biofilmes enriquecidos com bactérias redutoras de sulfato (BRS), representativos de tanques de plataformas de petróleo; e, (i i ) avaliar um coquetel fágico pré-selecionado quanto a potenciais impactos ambientais e operacionais. Os resultados obtidos demonstraram que os fagos avaliados possuem ação sobre esses biofilmes, com redução de cerca de 80% do H2S gerado e indicaram efeito na desaceleração do processo de corrosão e de formação de pits. Além disso, o coquetel fágico pré-selecionado, apresenta características vantajosas em comparação aos biocidas, tanto do ponto de vista ambiental (menor ecotoxicidade e maior biodegradabilidade), quanto operacional (menor corrosividade e menor impacto sobre o processo de nitrificação do sistema de tratamento biológico de água de produção). Palavras-chave: Biocorrosão. Corrosão Influenciada por Microrganismos. Acidulação Biogênica. Bactérias Redutoras de Sulfato. Sulfeto de Hidrogênio. H2S. Bacteriófagos.Item Bactérias psicrotróficas proteolíticas do leite cru refrigerado granelizado destinado à produção do leite UHT(Universidade Federal de Viçosa, 2004-05-03) Pinto, Cláudia Lúcia de Oliveira; Vanetti, Maria Cristina Dantas; http://lattes.cnpq.br/1351852178324888O objetivo deste trabalho foi investigar o efeito de fatores determinados pela granelização do leite cru refrigerado na estabilidade do leite. Foram enfati- zados os efeitos da temperatura de refrigeração e do tempo de estocagem na composição da microbiota contaminante do leite cru, na atividade proteolítica do leite, na atividade enzimática residual após tratamento UHT, bem como seu possível efeito na estabilidade do leite UHT. Amostras de leite cru coletadas em tanques de refrigeração, na fonte de produção e no silo de uma indústria processadora de leite UHT, foram analisadas quanto as suas características microbiológicas. Bactérias psicrotróficas proteolíticas Gram-negativas e Gram- positivas foram isoladas do leite cru refrigerado, sendo o gênero Pseudomonas o mais freqüentemente isolado, especialmente a espécie P. fluorescens. Bactérias Gram-positivas e Gram-negativas fermentadoras de glicose apre- sentaram predominantemente atividade proteolítica a 6,5, 21 e 35oC e bactérias Gram-negativas não-fermentadoras de glicose apresentaram um maior percentual de isolados com atividades associadas de proteases, lipases e lecitinases a 6,5 e 21oC, ressaltando seu maior potencial deteriorador. A presença de atividade de enzimas proteolíticas termorresistentes foi observada em sobrenadantes de culturas de bactérias psicrotróficas proteolíticas. A capacidade de adesão a superfícies de aço inoxidável foi constatada em bactérias psicrotróficas proteolíticas Gram-positivas e Gram-negativas até uma densidade de 10 5 células por cm 2 , quando inoculadas em leite desnatado esterilizado a 7oC, por 48 horas. Observou-se o crescimento de P. fluorescens inoculado em leite desnatado a 2, 4, 7 e 10°C, constatando-se o aumento de sua população, do grau de proteólise e da velocidade específica máxima de crescimento com o aumento da temperatura de estocagem. O tempo, em dias, para a perda de estabilidade térmica dessas amostras foi maior a 2 e a 4oC, em relação a 7 e 10oC. Por meio da eletroforese em gel de poliacrilamida obser- vou-se que a temperatura e o tempo de estocagem influenciaram na hidrólise das frações de caseína e da albumina. As amostras de leite cru integral, coletadas assepticamente e usadas como controle, não diferiram quanto aos perfis eletroforéticos após seis dias de estocagem, nas temperaturas avaliadas, demonstrando a importância de investimentos para a implementação de práticas higiênicas de obtenção e conservação da matéria-prima. O tratamento UHT reduziu, em média, 93,2% da atividade proteolítica presente no leite cru integral usado como matéria-prima para o processamento do leite UHT, indicando a presença de atividade proteolítica residual de origem bacteriana e, ou, endógena. Observou-se o aumento da massa de sedimentos, do grau de proteólise e da atividade proteolítica durante a estocagem do leite UHT integral a 37°C, por 120 dias. Em nenhuma das amostras de leite UHT foram consta- tadas contaminações por bactérias mesofílicas e por bactérias mesofílicas esporuladas, além de indícios de gelificação. Todas as amostras permane- ceram termicamente estáveis durante o período de validade do produto.Item Bacteriocinas de bactérias do ácido láctico isoladas de salame tipo italiano(Universidade Federal de Viçosa, 2005-10-27) Paula, Rosinéa Aparecida de; Moraes, Célia Alencar deBactérias do ácido láctico, isoladas de salame tipo italiano, com atividade antagonista a Listeria monocytogenes e Staphylococcus aureus foram caracterizadas. A natureza protéica dos agentes antagonistas nas seis linhagens foi demonstrada por serem conservadas em sobrenadantes neutralizados, pela não sensibilidade à catalase e pela sensibilidade a proteases. Cinco perfis de resistência a Proteinase K, Papaína, Tripsina e Protease de Bacillus polimyxa foram observados entre os seis isolados lácticos. Em todos os isolados, a atividade antagonista manteve-se presente em sobrenadantes neutralizados após tratamento térmico de 98 o C por 40 minutos. Em todos os isolados, a atividade inibitória manteve-se independentemente do pH do meio, entre pH 2 e pH 10. O isolado que apresentou melhor inibição contra L. monocytogenes e S. aureus, inclusive em meio líquido, foi identificado pela análise da seqüência de um gene codificador do rRNA 16S e pelo perfil de fermentação de açúcares como Lactococcus lactis subsp. lactis, e aqui denominado L. lactis subsp. lactis PD 6.9. O modo de ação da bacteriocina produzida por L. lactis subsp. lactis PD 6.9 sobre L. monocytogenes foi definido como bactericida. A produção de bacteriocina e o efeito inibitório sobre L. monocytogenes em condições que simulam o salame foram demonstrados. L. lactis subsp. lactis PD 6.9 atingiu 10 9 UFC/mL e a bacteriocina foi detectada após 8 horas. Em estudo de co-cultivo com L. monocytogenes, o crescimento de L. lactis subsp. lactis PD 6.9 não foi afetado pela presença de L. monocytogenes e apresentou o mesmo comportamento que quando cultivado como monocultura. Porém, o crescimento de L. monocytogenes foi reprimido e o número inicial de 10 6 células foi mantido até aproximadamente 12 horas de cultivo e nenhum crescimento foi detectado após 32 horas em um limite de detecção de 10 UFC/mL. A atividade da bacteriocina produzida por L. lactis subsp. lactis PD 6.9, em meio D-MRS, surge no final da fase logarítmica de crescimento e é máxima na fase estacionária. A atividade foi mais alta em condições ácidas do que em básicas, com atividade máxima em pH 2 e não foi alterada por tratamento térmico a 121 o C por 20 minutos, pelo processo de liofilização ou pelo efeito de congelamento e descongelamento. O armazenamento da bacteriocina nas temperaturas de -20 o C e -80 o C por até 6 meses também não alterou a atividade de inibição. A purificação foi realizada utilizando precipitação com sulfato de amônio, cromatografia de troca iônica, cromatografia de interação hidrofóbica e HPLC- fase reversa. Grande perda de atividade da bacteriocina foi observada especialmente após cromatografia de troca iônica e somente 0,025% da atividade inicial foi recuperada após HPLC-fase reversa. Os resultados obtidos com a purificação indicam que a bacteriocina é pequena, catiônica, hidrofóbica e com capacidade de formar agregados.Item Bioconversão de glicerina bruta da indústria do biodiesel em 1,3- propanodiol por bactérias isoladas de amostras ambientais(Universidade Federal de Viçosa, 2011-03-18) Melo, Marcelo Rodrigues de; Mantovani, Hilário Cuquetto; 9387195648186878O biodiesel é produzido por meio de reações de transesterificação entre óleos vegetais ou gorduras animais e álcoois (metanol ou etanol), resultando na formação de ésteres metílicos ou etílicos e glicerina bruta. Composto por glicerol, sabões, álcool, sais inorgânicos, ácidos graxos livres e outras matérias orgânicas, esse co- produto da indústria do biodiesel pode ser utilizado como substrato para produção microbiana de 1,3-propanodiol. Este diol tem sido produzido principalmente por vias petroquímicas e utilizado na produção de poliésteres, poliéteres, poliuretanos, solventes, adesivos, laminados, resinas, detergentes, anticongelantes e cosméticos. Neste trabalho, amostras de líquido de rúmen, solo, esgoto e dejetos suínos foram enriquecidas em meio contendo 5 % (v/v) de glicerina bruta, resultando no isolamento de 48 culturas produtoras de 1,3-propanodiol. As amostras de solo, esgoto e dejetos suínos contribuíram com 31, 12 e cinco culturas, respectivamente. Duas dessas culturas foram selecionadas para novos estudos e identificadas como Clostridium butyricum Sb06 e Klebsiella pneumoniae Ec18. K. pneumoniae Ec18 apresentou crescimento em concentrações de substrato (glicerol ou glicerina bruta) e 1,3-propanodiol de 200 e 80 g/L, respectivamente. Por outro lado, o crescimento de C. butyricum Sb06 foi totalmente inibido em concentrações de 160 e 40 g/L de substrato e 1,3-propanodiol, respectivamente. O crescimento dos isolados C. butyricum Sb06 e K. pneumoniae Ec18 foi favorecido em condições de neutralidade e os produtos da fermentação mais inibitórios ao crescimento foram o butirato e o acetato, respectivamente. O crescimento de C. butyricum Sb06 em meio basal, com e sem controle do pH do meio de cultivo, foi limitado a concentração de aproximadamente 1,5 g/L de biomassa, o que limitou a produção de 1,3-propanodiol em 10,23 g/L, com rendimento de 0,56 mol1,3-propanodiol/molglicerol. O controle do pH do meio de cultivo de K. pneumoniae Ec18 resultou em aumento de 2,5 vezes na formação de biomassa e produção 13,96 e 21,43 g/L de 1,3-propanodiol, com rendimento de 0,43 e 0,42 mol1,3-propanodiol/molglicerol, em meio contendo 40 e 80 g/L de glicerina bruta, respectivamente. As condições de cultivo de K. pneumoniae Ec18, na presença de 80 g/L de glicerina bruta, foram otimizadas utilizando de forma sequencial o delineamento fatorial fracionado e a metodologia de superfície de resposta, resultando em aumento de 56 % na concentração final de 1,3-propanodiol e de 22 % no rendimento de 1,3-propanodiol, em relação ao cultivo nas condições não- otimizadas. Os resultados deste trabalho indicam que o isolado K. pneumoniae Ec18 possui potencial para bioconversão de glicerina bruta em 1,3-propanodiol. Entretanto, outros estudos deverão ser realizados para a adequação do sistema de cultivo e a redução da formação de co-produtos da fermentação que competem com a formação de 1,3-propanodiol.Item Biodiversidade microbiana da Ilha da Trindade, prospecção genética e aplicações biotecnológicas utilizando micro-organismos autóctones(Universidade Federal de Viçosa, 2016-08-18) Rodrigues, Edmo Montes; Tótola, Marcos Rogério; http://lattes.cnpq.br/6584745594834479Esse estudo é iniciado com uma revisão bibliográfica em que aborda a biorremediação de hidrocarbonetos pesados e hidrocarbonetos aromáticos policíclicos (PAHs). Na revisão, são explorados aspectos que incluem a obtenção de micro- organismos com capacidade de degradar hidrocarbonetos, vias metabólicas de biodegradação, as consequências ambientais da contaminação e por fim aborda novos estudos que utilizam estratégias e novas tecnologias de biorremediação possíveis em ambientes aquáticos e solos. A parte experimental de nosso estudo segue a mesma linha de pesquisa desenvolvida durante o mestrado. De maneira preventiva, busca-se avaliar e desenvolver metodologias para biorremediar as adjacências da Ilha da Trindade, ambiente pristino e de valor ecológico, caso ocorram acidentes envolvendo o derramamento de hidrocarbonetos. Inicialmente, objetivamos avaliar o genoma dos isolados bacterianos autóctones da comunidade microbiana existente nas águas marinhas que circundam a Ilha da Trindade, Rhodococcus rhodochrous TRN7 e Nocardia farcinica TRH1, isolados durante o trabalho de mestrado como sendo capazes de degradar uma grande variedade de hidrocarbonetos de petróleo. Nosso objetivo também foi avaliar a estrutura da comunidade microbiana e o catabolismo de fenantreno após contaminação de microcosmos contendo água coletada na mesma região e utilizar micro-organismos autóctones como estratégia de bioaumentação. Por fim, objetivou-se desenvolver um produto biotecnológico baseado em emulsões duplas W/O/W fertilizadas, capaz de promover a bioestimulação sem a perda instantânea de nutrientes em águas oceânicas oligotróficas contaminadas por compostos orgânicos hidrofóbicos. Os genomas de R. rhodochrous TRN7 e N. farcinica TRH1 possuem genes de degradação de compostos alifáticos e aromáticos, sendo que 17 genes envolvidos com a biossíntese de antibióticos foram anotados com o genoma de R. rhodochrous TRN7, enquanto que no genoma de N. farcinica TRH1 foram identificados genes relacionados à degradação de caprolactam, precurssor do nylon, e do pesticida atrazina, o que torna ambos os isolados candidatos a serem empregados tanto em estratégias de bioaumentação quanto em outras áreas biotecnológicas. Após a contaminação de microcosmos com hidrocarbonetos, a comunidade microbiana da água litorânea da Ilha da Trindade passa a ser dominada por Gammaproteobacteria, grupo que compõe mais de 72% das sequências analisadas, enquanto que no tratamento controle houve predomínio de Proteobacteria (95% das sequências). Destaca-se a abundância de representantes do gênero Alteromonas, presentes em todos os tratamentos contaminados, com maior valor de abundância (66% das sequências) no tratamento contendo apenas fenantreno como contaminante. Decorridos 30 dias da contaminação, os valores de diversidade foram reduzidos, havendo domínio de grupos bacterianos reconhecidos pela presença de membros com atividade hidrocarbonoclástica. A capacidade de mineralização de fenantreno pela microbiota autóctone da Ilha da Trindade é reduzida quando outros PAHs e hidrocarbonetos de alto peso molecular estão presentes no ambiente. Em relação às emulsões produzidas, nossos resultados mostraram que elas podem ser utilizadas com o propósito de liberação gradual de nutrientes na fase aquosa dispersa. A emulsão é composta por gotículas que variam em um amplo espectro de tamanho que se desestabilizam temporalmente, resultando na liberação da inorgânicos. Quando utilizadas em hidrocarbonoclásticas, fase aquosa conjunto em microcosmos interna, ou contendo não, água contendo nutrientes com bactérias litorânea da Ilha da Trindade contaminada com petróleo, as emulsões W/O/W fertilizadas proporcionaram aumentos significativos da atividade microbiana. Como conclusões, nosso trabalho mostrou que a contaminação por hidrocarbonetos resulta na perda de diversidade microbiana da comunidade microbiana da água litorânea da Ilha da Trindade, e que um ambiente considerado pristino possui microbiota capaz de degradar hidrocarbonetos. Por fim, conclui-se que emulsões duplas W/O/W fertilizadas são uma alternativa para proporcionar aumento significativo na atividade catabólica de hidrocarbonetos em ambientes marinhos oligotróficos.Item Biossurfactantes e nanopartículas de prata e cobre: síntese e efeito sobre fungos fitopatogênicos(Universidade Federal de Viçosa, 2017-10-30) Oliveira, Max Lenine Rezende de; Tótola, Marcos Rogério; http://lattes.cnpq.br/1818137727061019Neste trabalho foi avaliada a hipótese de que biossurfactantes e nanopartículas de prata (AgNps) e cobre (CuNps), estabilizadas com biossurfactantes, são eficazes na inibição de fungos fitopatogênicos in vitro e in vivo. Para tal, foram utilizados um ramnolipídeo, um extrato livre de células de um novo isolado de Bacillus subtilis LBBMA AP01, AgNps e CuNps produzidas utilizando-se sobrenadante de B. subtilis MV 126P ou glicose como redutores (ou catalisadores da reação). A estabilidade das nanopartículas foi também avaliada em resposta à adição de ramnolipídeo como agente estabilizante. Em placas de cromatografia onde se aplicou o extrato metanólico do isolado B. subtilis LBBMA AP01, foram encontradas manchas com valores de fator de retenção (Rf) semelhantes aos valores de padrões comerciais dos lipopeptídeos surfactina, iturina e fengicina. Foram obtidas nanopartículas de prata e cobre esféricas com tamanhos variáveis quando se utilizou glicose como agente redutor. O extrato de B. subtilis MV 126P não foi eficiente como catalisador da síntese de CuNps, sendo-o, porém, para a produção de AgNps. O ramnolipídeo mostrou-se eficiente na manutenção da estabilidade das nanopartículas, impedindo sua agregação e oxidação durante todo o período de avaliação (150 dias). Nos testes de inibição, foram utilizados três importantes fungos fitopatogênicos - Botrytis cinerea, Sclerotinia sclerotiorum e Phakopsora pachyrhizi. Foram avaliadas a germinação de esporos e escleródios e a formação de colônias resultantes do processo de germinação dessas estruturas. Avaliou-se também o crescimento micelial in vitro de B. cinerea e S. sclerotiorum e o índice de doença provocada por esses patógenos em pétalas de rosa e em folhas de repolho pulverizadas com soluções contendo nanopartículas e biossurfactantes. O extrato de B. subtilis LBBMA AP 01, o ramnolipídeo e as AgNps inibiram significativamente a germinação das estruturas reprodutivas dos três patógenos, além do crescimento micelial de B. cinerea e S. sclerotiorum in vitro. No experimento in vivo, o extrato de B. subtilis LBBMA AP 01, ramnolipídeo e as AgNps foram eficientes no controle da infecção por B. cinerea e S. sclerotiorum. Conclui-se que os agentes de controle avaliados nesse trabalho são promissores para utilização comercial. A avaliação de sua eficiência como agentes de controle de outras espécies de fungos fitopatogênicos pode expandir o potencial de aplicação desses compostos, em substituição aos fungicidas convencionais. Essa possibilidade é de grande relevância ambiental e para setores específicos, como o de agricultura orgânica. Palavras chave: lipopeptídeo, ramnolipídeo, nanopartículas metálicas, fungos fitopatogênicos e biofungicida.Item Biossurfactantes e Polímeros de Bacillus subtilis RI4914 e sua Aplicação em Recuperação Avançada de Petróleo(Universidade Federal de Viçosa, 2011-09-01) Fernandes, Péricles Leonardo; Tótola, Marcos Rogério; 9781385135118198Neste trabalho foram realizados experimentos com o intuito de avaliar-se a propriedade dos biossurfactantes produzidos pelo isolado Bacillus subtilis RI4914 em reduzir a tensão interfacial e promover a recuperação de óleo residual em colunas empacotas com areia. Foi observado que a solução de biossurfactantes é capaz de mobilizar até 40% do óleo residual das colunas, porém somente em concentrações elevadas (2,0 g L-1). Por outro lado, a utilização do sobrenadante da cultura do isolado RI4914 proporcionou recuperação de óleo superior à alcançada com a solução dos biossurfactantes e em concentração dez vezes menor da molécula. Tais resultados indicam a produção de compostos capazes de atuar sinergisticamente com os biossurfactantes na redução da tensão interfacial, alcançando valores de até 0,07 mN/m. Além disso, destaca- se a produção espontânea de polímero pela bactéria, molécula esta capaz de aumentar a viscosidade do sobrenadante e reduzir quase que pela metade o volume necessário para uma recuperação satisfatória de óleo residual. Os biossurfactantes apresentaram características físico-químicas comparáveis às do surfactante sintético SDS. Em termos de estabilidade, as moléculas demonstraram ter sua atividade pouco influenciada por condições extremas, principalmente no que se diz respeito às altas temperaturas. Esses resultados foram comprovados quando o sobrenadante da cultura foi avaliado quanto a sua capacidade em promover a recuperação do petróleo residual em salinidades variando entre 3 e 10% (p/v) de NaCl e em uma faixa de pH de 6,0 a 9,0. A recuperação de óleo pelo sobrenadante da cultura demonstrou ser também pouco influenciada pelas condições ambientais testadas, chegando a recuperar 88% do petróleo residual na presença de polímero. Esses resultados comprovam que os biossurfactantes descritos neste trabalho são substitutos em potencial para os surfactantes sintéticos frequentemente utilizados na indústria do petróleo.Item Características moleculares e identificação de Lactobacillus delbrueckii UFV H2b20(Universidade Federal de Viçosa, 2003-02-20) Neves, Juliana Teixeira de Magalhães; Moraes, Célia Alencar de; http://lattes.cnpq.br/6418658381112019A estirpe probiótica Lactobacillus UFV H2b20, previamente classificada como Lactobacillus acidophilus por suas características de fermentação de açúcares, apresentou-se mais semelhante à espécie Lactobacillus delbrueckii, quanto à seqüência de rDNA 16S, o que levou ao questionamento acerca da identidade da linhagem. Para o esclarecimento da real classificação da linhagem, o método de hibridização DNA-DNA foi empregado. A linhagem apresentou 75,2% e 77,4% de reassociação com L. delbrueckii subsp. lactis (ATCC 12315) e L. delbrueckii subsp. delbrueckii (ATCC 9649), respectivamente. Dado que a homologia de 70% ou mais, por esse método, tem sido usada como padrão para agrupamento de bactérias em uma mesma espécie, sugere-se, aqui, que Lactobacillus UFV H2b20 seja, daqui para frente, denominado L. delbrueckii UFV H2b20. Identificada a linhagem, outro objetivo do trabalho era desenvolver um protocolo para detecção in situ de L. delbrueckii. Uma sonda de 26 nucleotídeos (SA) foi construída e testada com outras espécies de Lactobacillus relacionadas geneticamente entre si. Estes estudos demonstraram que a seqüência de assinatura (SA) estava presente em L. delbrueckii UFV H2b20, L. delbrueckii UFV H2b21, L. delbrueckii subsp. delbrueckii e L. delbrueckii subsp. lactis, o que indica ser ela eficaz para ser usada como sonda para rRNA 16S espécie-específica pelo método de FISH. A hipótese de existência de polimorfismos, levantada em trabalhos prévios no rDNA 16S da linhagem, foi confirmada após as análises dos segmentos de DNA clonados e selecionados do banco genômico construído para a linhagem L. delbrueckii UFV H2b20. As seqüências analisadas demonstraram, também, presença de segmentos correspondentes a quatro genes codificadores de rRNA 16S distintos, e seis segmentos distintos para uma mesma região de rRNA 23S, indicando seis operons putativos. Há evidência de, pelo menos, um operon putativo completo seguido de região codificadora de seis tRNAs. Não se detectou região espaçadora longa entre rDNA 16 e 23S.Item Caracterização de microrganismos e sucessão da comunidade microbiana em silagem de cana-de-açúcar(Universidade Federal de Viçosa, 2016-02-23) Oliveira, Wemerson de Castro; Mantovani, Hilário Cuquetto; http://lattes.cnpq.br/4906043209502220Em países de clima tropical, a silagem de cana-de-açúcar tem sido preconizada para uso na alimentação de ruminantes. No entanto, a cana-de-açúcar ensilada pode ter a qualidade diminuída devido à presença de microrganismos indesejáveis, como as leveduras. O interesse em compreender a dinâmica da sucessão microbiana durante a fermentação da cana-de-açúcar está relacionado com as perdas nutricionais associadas com a fermentação alcoólica causada pelas leveduras. Neste estudo, foram isoladas e caracterizadas 99 culturas de leveduras e 164 culturas de bactérias obtidas da cana in natura e da silagem de cana-de-açúcar obtidas em diferentes tempos de fermentação (1, 3, 7, 14, 21 e 28 dias). Além disso, a análise da composição da comunidade bacteriana e fúngica da silagem de cana-de açúcar foi realizada utilizando a técnica de PCR-DGGE. Foram identificadas dez espécies de leveduras pertencentes aos gêneros Candida, Pichia, Meyerozyma e Torulaspora. As espécies Pichia kudriavzevii e Candida glabrata foram abundantes em todos os períodos de fermentação, representando 45% e 29% do número total de leveduras isoladas, respectivamente. Também foram identificados isolados bacterianos pertencentes a 21 gêneros diferentes, incluindo bactérias do ácido láctico e bactérias aeróbias. O gênero Weissella foi o mais abundante nos primeiros dias de fermentação, representando 34,7% dos isolados da cana-de- açúcar, enquanto o gênero Lactobacillus predominou na fase mais tardia da fermentação, com 22,9% dos isolados. Sessenta e nove isolados inibiram o crescimento de Listeria monocytogenes in vitro e, dentre estes, 18 inibiram ao mesmo tempo L. monocytogenes, Escherichia coli e Bacillus subtilis. A análise da diversidade genética da comunidade bacteriana das amostras avaliadas indicou diferenças entre a cana in natura e a silagem após 28 dias de fermentação. O índice de riqueza de espécies do Domínio Bacteria reduziu 34,5% e 27,6% no grupo de leveduras após 28 dias de fermentação. Entretanto, os índices de diversidade foram semelhantes entre os períodos de fermentação avaliados. A análise de diversidade de Firmicutes e γ-Proteobacteria, indicou aumento de 40% na riqueza de membros do filo Firmicutes após 28 dias de fermentação e redução de 38,1% de representantes da Classe γ-Proteobacteria. A avaliação da composição da microbiota da silagem de cana-de-açúcar indicou o predomínio de algumas espécies de bactérias e leveduras durante a ensilage que poderão ser utilizadas como alvos para o desenvolvimento de aditivos visando melhorar a qualidade nutricional da silagem de cana-de-açúcar.Item Caracterização fisiológica de mutantes Kluyveromyces lactis ∆hap1 e ∆rox1 sob aerobiose e hipoxia(Universidade Federal de Viçosa, 2005-05-15) Macêdo, Cláudia Souza Macedo; Passos, Flávia Maria Lopes; http://lattes.cnpq.br/5335251554582575Na busca de novos resultados para elucidar o papel de HAP1 e ROX1, que codificam um ativador do metabolismo oxidativo e um repressor do metabolismo oxidorredutivo, respectivamente, na levedura Crabtree negativa Kluyveromyces lactis cuja versatilidade metabólica pode ser explorada em vários campos da biotecnologia, inicialmente, foi identificado um gene ortólogo ROX1 à S. cerevisiae na seqüência genômica de K.lactis. O gene KlROX1 possui 40% de identidade daquele presente em S. cerevisiae e um motif característico do domínio HMG (High Mobility Group). Com base nessa seqüência uma linhagem mutante com deleção de ROX1 foi construída e confirmada. O fenótipo URA + e rox1 - dos transformantes obtidos, K.lactis ∆rox1::URA3, foram 100% estáveis sob condição seletiva. O gene putativo ROX1 de K.lactis teve a sua função em resposta ao oxigênio confirmada em culturas de K. lactis sob regime contínuo e desrepressão por glicose, pois, a deleção de ROX1 induziu a um aumento no nível do transcrito do gene hipóxico HEM13. A análise dos produtos do metabolismo permitiu inferir que a deleção do gene ROX1 em K. lactis aumentou a capacidade fermentativa dessa levedura sob aerobiose e de desrepressão catabólica. A investigação em culturas K. lactis ∆hap1 submetidas ao cultivo contínuo aeróbico sob desrepressão por glicose revelou um fenótipo relacionado ao metabolismo oxidorredutivo, ou seja, K. lactis ∆hap1 é mais fermentativa levando a diversidade de metabólitos em torno do piruvato. A proposta da via de regulação parcial negativa controlando a expressão de HEM13 foi confirmada nas culturas K. lactis.Item Caracterização genômica de profagos e de bactérias do gênero Desulfovibrio(Universidade Federal de Viçosa, 2018-07-16) Crispim, Josicelli Souza; Paula, Sérgio Oliveira de; http://lattes.cnpq.br/5230945928388455Bactérias do gênero Desulfovibrio pertencem ao grupo de Bactérias Redutoras de Sulfato (BRS). As BRS causam significativos prejuízos à indústria de petróleo, principalmente devido à capacidade de causar corrosão microbiologicamente induzida, formação de biofilme e produção de H2S. Bacteriófagos são uma forma alternativa para o controle biológico das BRS, cuja informação para este grupo de bactérias, entretanto, é escassa. Assim, este trabalho teve como objetivos: 1) identificar e caracterizar profagos em genomas de Desulfovibrio; 2) verificar a expressão de profagos de Desulfovibrio alaskensis; 3) Isolar, sequenciar e montar genomas de BRS. Para identificação de profagos de Desulfovibrio foram utilizados 46 genomas depositados em banco de dados. 53 profagos completos foram identificados em 46 dos genomas analisados. Estes foram classificados dentro da ordem Caudovirales, com 69,82% pertencentes à família Myoviridae. 18 profagos identificados possuem genes que codificam para lisozima e holina. Quatro dos genomas analisados apresentam profagos com identidade acima de 50% na mesma linhagem, cuja análise comparativa demonstrou a existência de colinearidade entre as sequências. Dos 17 genomas bacterianos fechados analisados, 6 possuem sistema CRISPR-Cas classificado como inativo. A identificação da poli-lisogenia, a proximidade entre os profagos completos e a possível inatividade do CRISPR-Cas nos genomas fechados analisados, permitiu a escolha de linhagens poli-lisogênicas com profagos pertencentes à família Myoviridae para isolamento de profagos e testes em linhagens relacionadas para estudos posteriores. A linhagem D. alaskensis DSM16109 possui três profagos, cuja a expressão e a relação com vesículas de membrana externa foram verificados neste trabalho. A linhagem DSM16109 apresentou menor crescimento após a adição de mitomicina C em relação à cultura controle. Esta redução foi acompanhada da presença de partículas virus-like (VLPs), indicando indução de profagos por mitomicina C. Foi verificado o aumento do número de cópias dos genes cap dos três profagos e transcrição dos mesmos na amostra controle, entretanto, sem a formação de VLPs. Genes de profagos foram identificados em vesículas de membrana externa de culturas tratadas e não tratadas com mitomicina C. Os profagos de DSM16109 são induzidos de forma espontânea, mas, apenas a presença de mitomicina C levou à formação de VLPs. O material genético dos profagos detectado dentro de vesículas de membrana externa podem estar relacionados com a transferência horizontal de genes virais. Nas análises genômicas de isolados de amostras de plataformas de extração de petróleo da Bacia de Campos (RJ) foi verificado que a linhagem P37SLT pertence à espécie Desulfovibrio indonesiensis com 4,2Mb e a linhagem P48SEP pertence à espécie Desulfovibrio marinus com 5,1Mb. Ambas as linhagens foram sequenciadas pelo sistema HiSeq (2x300) e apresentam sequências relacionadas à profagos, uma característica comum do gênero Desulfovibrio encontrada nos genomas anteriormente analisados.Item Caracterização molecular e de fatores de virulência de Klebsiella sp. isoladas de dietas enterais(Universidade Federal de Viçosa, 2001-12-10) Pereira, Simone Cardoso Lisboa; Vanetti, Maria Cristina Dantas; http://lattes.cnpq.br/4505783211336103A identificação morfo-tintorial e bioquímica de 21 isolados de Klebsiella provenientes de amostras de dietas enterais artesanais revelou que 15 deles pertenciam a espécie K. pneumoniae e seis a K. oxytoca. A sorotipagem de K. pneumoniae identificou cinco isolados do sorotipo K5, um do sorotipo K4 e os demais não foram sorotipados pelos antissoros dos grupos K1 a K6. Os resultados das análises por RAPD e da região espaçadora 16S-23S do rDNA mostraram um polimorfismo acentuado entre os isolados de K. pneumoniae e um polimorfismo menor entre os isolados de K. oxytoca. O fragmento de DNA, de 1420 pb, gerado pela amplificação da região 16S do rDNA foi digerido por oito endonucleases de restrição e resultou padrões de RFLP idênticos para todos os isolados. As análises por RAPD e por PCR da região espaçadora do rDNA mostraram-se apropriadas para avaliar a diversidade genética entre estes isolados. A resistência a pelo menos dois antibióticos foi verificada em todos os isolados de Klebsiella e maior prevalência de resistência foi verificada aos antibióticos amoxacilina e ampicilina. Os isolados que apresentaram resistência a um maior número de antibióticos pertenciam a espécie K. pneumoniae provenientes, principalmente, do hospital B. A produção de β-lactamase de espectro ampliado não foi verificada em nenhum dos isolados avaliados. Observou-se que a freqüência de colônias mucóides entre as estirpes foi baixa (23,8%) e que a produção de cápsula foi verificada, microscopicamente, somente nas estirpes, cujas colônias apresentaram aspecto mucóide. K. pneumoniae apresentou maior adesão em células Caco-2 e HEp-2 enquanto K. oxytoca apresentou adesão expressiva apenas em células Caco-2. Porém, a invasão de K. pneumoniae foi constatada nas três linhagens de células eucarióticas, apesar dos índices terem sido baixos em relação aos de adesão. Somente os isolados da espécie K. pneumoniae apresentaram adesão e invasão nas células HEp-2. De uma forma geral, os índices de adesão e invasão foram maiores entre os isolados do hospital A. Nas condições usadas neste estudo, os isolados de Klebsiella não apresentaram atividade hemolítica, de fosfolipase e produção de enterotoxina termoestável, assim como do sideróforo aerobactina. A inoculação intraperitoneal em camundongos sadios e imunodeprimidos com estirpes selecionadas de Klebsiella para a determinação da DL 50 não promoveu a morte dos animais, até uma concentração de 10 7 células por inoculação. Quando camundongos foram alimentados com dietas enterais ou ração não se observou a presença de colônias típicas de Klebsiella na análise de amostras do fígado, baço, coração, rim e pulmão dos animais. Entretanto, em amostras de fígado e pulmão dos camundongos dos grupos que receberam drogas imunodepressoras e, ou antimicrobiana, alimentados ou não com dieta enteral contaminada com 6 x 10 9 UFC/animal de Klebsiella, a presença de colônias típicas foi constatada. Em animais que receberam somente a dieta contaminada, a translocação de Klebsiella também foi observada. A análise do perfil genético, por RAPD, de isolados recuperados desses órgãos revelou similaridades com os padrões de bandas de DNA das estirpes de Klebsiella administradas aos animais, via oral. A presença de Klebsiella no fígado de camundongos que não receberam fonte exógena de Klebsiella, mas que receberam a combinação de medicamentos, sugere que estirpes da microbiota intestinal autóctone foram capazes de translocar quando houve uma depressão do sistema imunológico e uma descontaminação seletiva, promovidas pelo corticóide e antibiótico, respectivamente. A colonização por Klebsiella, proveniente das dietas enterais, no intestino também foi facilitada quando medicamentos imunodepressores e antimicrobianos foram utilizados.Item Caracterização, distribuição e estudo da atividade de elementos transponíveis em Crinipellis perniciosa, agente causal da vassoura-de-bruxa no cacaueiro (Theobroma cacao)(Universidade Federal de Viçosa, 2005-12-20) Pereira, Jorge Fernando; Queiroz, Marisa Vieira de; http://lattes.cnpq.br/1568875950216131Neste trabalho, elementos transponíveis da Classe I e da Classe II foram caracterizados no genoma do fungo Crinipellis perniciosa, agente causal da enfermidade conhecida como vassoura-de-bruxa no cacaueiro. C. perniciosa apresenta uma alta variabilidade genética e elementos transponíveis têm sido relatados como um dos principais agentes responsáveis pela alta plasticidade e adaptabilidade apresentada por fungos fitopatogênicos. Buscas preliminares feitas no banco de dados do Projeto Genoma da Vassoura-de-Bruxa revelaram a presença de uma seqüência de DNA com similaridade a transcriptase reversa de elementos da Classe I pertencente ao grupo gypsy/Ty3. Esta seqüência foi amplificada em diferentes isolados de C. perniciosa que pertencem aos biótipos C, S e L e distintas regiões geográficas. Seqüenciamento de fragmentos amplificados revelaram a ocorrência de vários eventos de transição G:C para A:T, indicando a existência de um possível mecanismo de silenciamento tipo RIP. Análises de hibridização mostraram a presença de um alto número de cópias da região que codifica a transcriptase reversa e diferentes perfis de hibridização nos isolados dos biótipos C, S e L, indicando que os elementos que contém estas seqüências podem ter um importante papel na variabilidade de C. perniciosa. O fragmento de DNA contendo a seqüência de transcriptase reversa foi utilizado para o isolamento de fagos recombinantes em um banco genômico de C. perniciosa. Retrotransposons do grupo gypsy/Ty3, denominados CpSaci1 e CpSaci2, foram caracterizados a partir de uma nova seqüência presente no banco de dados do Projeto Genoma da Vassoura-de- Bruxa e de um dos fagos recombinantes obtidos. CpSaci1 possui 6.856 pares de bases (pb) e contém longas repetições terminais (LTRs) diretas de 423 pb que não apresentam regiões normalmente encontradas em LTRs de retrotransposons. Duas seqüências de leitura aberta (ORFs) foramidentificadas codificando peptídeos similares à GAG e à poliproteína POL contendo os domínios protease, transcriptase reversa, RNase H e integrase. A seqüência de DNA de CpSaci2, que foi parcialmente caracterizada, possui cerca de 82% de identidade com CpSaci1. Estas duas cópias apresentam inserções de bases e códons de parada na região estrutural indicando que se tratam de cópias inativas. Entretanto, análises por RT-PCR revelaram a presença de transcritos CpSaci normalmente expressos em C. perniciosa cultivado em meio mínimo, e que, sob condições de estresse nutricional, apresentaram uma maior expressão. CpSaci está presente em alto número de cópias no genoma dos biótipos C, S e L de C. perniciosa, sendo que isolados do biótipo C originados do estado da Bahia apresentam dois perfis de hibridização, e alguns fragmentos de DNA em comum com isolados da região amazônica. Por possuir alto número de cópias e ser ativo, o retrotransposon CpSaci provavelmente está relacionado com a geração de variabilidade genética em C. perniciosa. Além do retrotransposon CpSaci, elementos transponíveis da Classe II também foram caracterizados. As cópias denominadas Boto1 e Boto2 foram obtidas a partir do banco de dados do Projeto Genoma da Vassoura-de-Bruxa e a partir de um fago recombinante isolado de um banco genômico de C. perniciosa, respectivamente. Boto1 é flanqueado por uma duplicação de 3 pb (TAA) e possui duas ORFs, uma que codifica uma transposase e outra que codifica uma proteína com baixa similaridade a um regulador da transcrição de plantas. As regiões estruturais que codificam as transposases de Boto1 e Boto2 são interrompidas por um intron de 53 pb com alto conteúdo A+T. As transposases de Boto1 e Boto2 são altamente similares à transposases de elementos PIF-like. Estas transposases são relacionadas à transposases de seqüências de inserção do grupo IS5 de bactérias e fazem parte de uma nova família de transposons da Classe II denominada PIF/IS5. A superfamília PIF/IS5 é raramente encontrada em fungos, e como análises filogenéticas indicam que as transposases Boto-like formam um ramo evolutivo independente, estas seqüências parecem ter sido transferidas horizontalmente para o genoma de C. perniciosa. Transcritos Boto- like foram amplificados por RT-PCR em C. perniciosa normalmente cultivado em meio de cultura, mas não foram ativados por estresse nutricional. Este é o primeiro relato de elementos da superfamília PIF/IS5 em um fungo fitopatogênico.Item Characterization of Klebsiella spp from healthy swine: virulence, resistance to antimicrobials and gene transferer mediated by extracellular vesicles(Universidade Federal de Viçosa, 2023-07-28) Rosa, Jéssica Nogueira; Bazzolli, Denise Mara Soares; http://lattes.cnpq.br/5515162837114472Bacteria of the Klebsiella genus belong to the Enterobacteriaceae family, are Gram-negative and exhibit different habitats and ecological functions, especially in other hosts. The most studied species is Klebsiella pneumoniae, a bacteria naturally found in the intestinal microbiota and na important opportunistic pathogen. The virulence factors attributed to K. pneumoniae are the production and secretion of siderophores, type I and III fimbriae, polysaccharide capsules, lipopolysaccharides (LPS), secretion system (T6SS) and extracellular vesicles (EVs). Factors involved with virulence and antimicrobial resistance are variable and encoded by different genes. Theses genes can be acquired by horizontal transfer (THG) with the effective participation of mobile genetic elements (MGE), such as plasmids and conjugative integrative elements (ICE). Swine have Klebsiella spp as members of the intestinal microbiota and may be reservoirs of this genus with genetic markers of virulence and resistance. Therefore, this work had the following objectives: to isolate Klebsiella spp from healthy swine in growth phase II; characterize the phenotype and genotype of virulence and antimicrobial resistance; to investigate the contribution of ICEs to their ecological niche as well as horizontal gene transfer mediated by extracellular vesicles (EVs). As a result of chapter 1, 144 Klebsiella spp isolates were obtained, of which 77% were identified as K. pneumoniae, 14.5% Klebsiella aerogenes, and 8.5% Klebsiella variicola. In the isolates obtained, the following resistance profile was observed: β-lactams (100 %), cephalosporins (75.5 %), fluoroquinolones (51 %), phenicol (48.8 %), tetracycline (55.5 %), macrolide (37.7%), sulfonamide (35.5%), aminoglycoside (8.8%), trimethoprim (4.5%). Overall, 88.8% of the isolates were characterized as multidrug-resistant (MDR). Important virulence phenotypes and genotypes were identified as siderophore production (entB, iucB, iutA, kfu and ybtS/irp2) and biofilm, where 39% are classified as strong producers, 45% moderate and 16% as weak producers. The hypermucoviscous phenotype was not verified in the investigated isolates, however the iutA marker gene was identified in 19 isolates (42.2%). From the presented results, 11 isolates of K. pneumoniae MDR were selected for investigation of the type of sequence (STs) and they were classified as ST25, ST147, ST616, ST691 and ST6208. Thus, two isolates were selected for genome sequencing (chapter 2), K. pneumoniae HS-144 and K. pneumoniae HS-13. Functional annotation revealed classes such as metabolism of carbohydrates, amino acids, and proteins (37.6%); membrane transport (5.7%); cell regulation and signaling (3.5%); DNA metabolism (3.5%); virulence, disease and defense (3.1%); cell wall and capsule (5.2%) and others. Klebsiella pneumoniae HS-144 and K. pneumoniae HS-13 carry plasmids. Of the two strains, only genes involved in the complete conjugation apparatus (T4SS, T4CP, relaxase and oriT) and a phage carrying the blaSHV2 gene were identified in the HS-144 strain. For this strain (HS-144) the ESBL - extended-spectrum β- lactamase phenotype was also confirmed. Thus, a biparental conjugation assay using K. pneumoniae HS-144 as a donor and E. coli J53 as recipient (selection with colistin). Three transconjugants were obtained (MIC for colistin >64mg.mL-1), confirming the mobilizable nature of genetic determinants involved with resistance to colistin, a drug as a last resort in the treatment of K. pneumoniae in the human clinic. In chapter 3, 949 complete genomes of K. pneumoniae were investigated in order to characterize integrative and conjugative elements in the species. Of all the analyzed genomes, 501 genomes presented one or more potential regions with self-transfer capability, and 18.2% of these present co-occurrences with other ICEs. We detected 19 new ICE candidates. The new ICEs carry genes related to iron adhesion and absorption, capsule biosynthesis, cell wall and LPS, stress response, membrane components and resistance to arsenic, β-lactam, polymyxin and novobiocin. In addition, we also mapped four new ICEs that carry the highly pathogenic Island Yersinia (HPI). In Chapter 4, we investigated the importance of extracellular vesicles (EVs) in gene transfer between human and swine Klebsiella spp. EVs-Kp13 (K. pneumoniae Kp13) were obtained by the hydrostatic filtration method. The EVs obtained had an average size of 182 nm and rounded morphology. In this work, it was confirmed that EVs-Kp13 carry genes for resistance to sulfonamide (sul2), cephalosporins (blaCTXM2, blaSHV, blaTEM), carbapenems (blaKPC) and trimethoprim (dfrA15). Furthermore, it was detected that EVs-Kp13 carry genes that code for the siderophore yersiniabactin. Our blistering results were positive when using the K. aerogenes 270 strain as recipient, isolated from healthy swine. Four transvesiculants were obtained that showed resistance to cephalosporins (third and fourth generation) and trimethoprim, in addition to the marker genes of plasmid pKP13f. We can conclude that clinically healthy swine have Klesiella spp with a clinically relevant MDR and virulence phenotype in their normal microbiota. Klebsiella pneumoniae can also carry mobile genetic elements such as plasmids and ICEs that help their fitness in different environments. And finally, vesiduction can be an important means of disseminating resistance genes in Klebsiella spp. This study elucidates important gene flow routes between different species and reservoirs, significantly contributing to the unified health approach. Keywords: One health. Multidrug resistant. Microbial fitness. Vesiduction.