Análise in silico e caracterização funcional de RNAs pequenos reguladores: alvos e fenótipos envolvidos em Actinobacillus pleuropneumoniae

Abstract

Actinobacillus pleuropneumoniae (App) é o agente causal da pleuropneumonia suína, doença que causa uma pleuropneumonia fibrinosa, exsudativa, hemorrágica, necrosante, que afeta porcos de todas as idades, levando à morte súbita e grandes perdas econômicas em todo o mundo. Existem dois métodos básicos para limitar a infecção endêmica de App: antibióticos e vacinas, mas a segunda opção não é eficiente para controlar a pleuropneumonia porcina. A virulência de App é complexa e envolve diferentes fatores bacterianos que incluem exotoxinas, polissacarídeos capsulares e lipopolissacarídeos. Além disso, existem fatores adicionais de virulência que são up- ou down-regulados durante a infecção e pequenos RNAs reguladores (sRNAs) podem regulá-los. Recentemente, nosso grupo identificou 23 sRNAs em App, cuja transcrição foi validada por RNA-Seq. Neste trabalho selecionamos seis genes sRNA e produzimos mutantes de deleção a partir dos parentais selvagem (WT_ΔsRNA) e de seu mutante isogênico para a chaperona de sRNAs, Hfq (Δhfq_ΔsRNA). Além disso, propomos uma análise robusta in silico da estrutura, conservação e interação dos RNAs de App com seus alvos. Os fenótipos desses mutantes foram comparados aos da linhagem parental sob diferentes condições, como: curva de crescimento, crescimento sob diferentes condições de estresse, determinação da concentração inibitória mínima contra antibióticos, adesão em superfícies bióticas e abióticas, atividade hemolítica e virulência no modelo alternativo de infecção, Galleria mellonella. As linhagens ΔsRNA exibiram uma diferença fenotípica em relação às linhagens parentais sob pelo menos uma condição, revelando que os sRNAs de App estão envolvidos na regulação da virulência. Notavelmente, alguns mutantes de deleção simples mostraram um fenótipo de ganho de função, que ainda não foi descrito para nenhum outro mutante de deleção de gene de sRNA na família Pasteurellaceae. Além disso, um mutante mostrou uma forte atenuação de virulência, sendo um candidato para elaboração de uma vacina viva atenuada contra A. pleuropneumoniae. As análises in silico revelaram a presença de sRNAs de App em seis gêneros da família Pasteurellaceae. Vários alvos foram encontrados e categorizados em diferentes funções, evidenciando uma complexa rede de regulação gênica para esses RNAs. A partir desses resultados, propomos um modelo de ação via Arrc14 em que ele atua como regulador negativo no metabolismo de amino e nucleotídeo açúcares. Nossos resultados permitem concluir que os sRNAs aqui estudados interferem de forma distinta na regulação da virulência de Actinobacillus pleuropneumoniae sorotipo 8. Concluímos ainda que, com base nos dados obtidos para RNA01, a linhagem WT_Δrna01 possui potencial para ser utilizada no desenvolvimento de uma vacina atenuada viva para prevenir e controlar infecções por Actinobacillus pleuropneumoniae.Actinobacillus pleuropneumoniae (App), the porcine pleuropneumonia´s causative agent, a fibrinous, exudative, hemorrhagic, necrotizing pleuropneumonia affecting pigs of all ages, leading to sudden death and great economic loss worldwide. There are two basic methods used to limit endemic infection of App: antibiotics and vaccines, but the second option is not efficient to control porcine pleuropneumonia. The App virulence is complex and involves different bacterial factors including exotoxins, capsular polysaccharides, and lipopolysaccharides. Beyond these, there are additional APP virulence factors that are down- or up-regulated during infection and regulatory small RNAs (sRNAs) can regulate them. Recently, our group identified 23 sRNAs in App, whose transcription was validated by RNA-Seq. In this work we selected six sRNA genes and produced deletion mutants from wild-type parental (WT_ΔsRNA) and its isogenic mutant for the sRNA chaperone, Hfq (Δhfq_ΔsRNA). In addition, we propose a robust in silico analysis of the structure, conservation and interaction of APP sRNAs with their targets. The phenotypes of these mutants were compared to that of the parental strain under different conditions, i.e. growth curve, growth under different stress conditions, determination of minimum inhibitory concentration against antibiotics, adhesion on biotic and abiotic surfaces, hemolytic activity and virulence in the alternative infection model Galleria mellonella. The sRNA strains exhibited a phenotype difference from the parental strains under at least one condition, revealing that App sRNAs are involved in virulence regulation. Notably, simple deletion mutants showed a gain of function phenotype, which has not yet been described for any other sRNA gene deletion mutant in the Pasteurellaceae family. In addition, a mutant showed a strong attenuation of virulence, being a promising live-attenuated vaccine candidate against App. In silico analysis revealed the presence of App sRNAs in six genera of the Pasteurellaceae family. Several putative targets were found and categorized in different functions, evidencing a complex gene regulation network by these sRNAs. From these results, we propose a model of action via Arrc14 in which it acts as a negative regulator in amino and nucleotide sugars metabolism. Our results allow us to conclude that the sRNAs studied here interfere differently in virulence regulation of Actinobacillus pleuropneumoniae serotype 8. We also conclude, based on the data obtained for RNA01, that the WT_Δrna01 line has potential to be used in the development of a live attenuated vaccine to prevent and control Actinobacillus pleuropneumoniae infections.