Assessment of ethanol tolerance of Kluyveromyces marxianus CCT 7735 selected by adaptive laboratory evolution

Abstract

Whey is a by-product formed during the cheese-making, which presents lactose (4.5-5% w/v), soluble proteins, lipids, mineral salts and other components. It is the most abundant liquid waste generated in the dairy industries, which can lead to the pollution of water bodies due to its high biochemical oxygen demand and chemical oxygen demand. Whey permeate (WP) is a by-product constituted by lactose, produced from whey ultrafiltration. This way, WP can be converted by lactose-assimilating microorganisms, like yeasts, into value-added products. Kluyveromyces marxianus CCT 7735 has been showing a great potential for producing ethanol from lactose. However, its low ethanol tolerance is a drawback to be overcome, i. e., its growth is highly inhibited from 4% of ethanol (v/v). Adaptive laboratory evolution was used to select ethanol-tolerant K. marxianus CCT 7735 strains (ETSs). ETSs were grown under ethanol stress (4%, v/v) for long periods of time, over many generations (310-340 number of generations), in order to select the ethanol-tolerant phenotypes. From the determination of the physiological parameters, ETSs did not present alterations in their fermentative capacity, when compared their parental strains. However, ETS4 strain stood out for displaying a specific growth rate higher than the parental strain under ethanol stress (above 100%) and a specific ethanol production rate superior to all strains evaluated in this work. The metabolomic and fatty acids analysis were carried out with both ETS4 and parental strains to gain insights into the mechanisms related to the acquisition of ethanol tolerance. The accumulation of some amino acids (glutamate, alanine, valine, proline, and leucine) and metabolites of the citric acid cycle (isocitric acid, citric acid, cis-aconitic acid and malic acid) in ETS4 was found to be associated with the acquisition of ethanol tolerance. Furthermore, high fatty acids content and ergosterol in ETS4 compared to the parental strain indicate differences in their plasma membrane composition, which is consistent with metabolite leakage observed in the parental strain. Therefore, the accumulation of amino acids and citric acid cycle metabolites, as well as the alteration in the fatty acid and ergosterol contents contributed to the acquisition of ethanol tolerance in K. marxianus.O soro é um subproduto formado durante a fabricação do queijo, constituído por lactose (4,5-5% m/v), proteínas solúveis, lipídios, sais minerais e outros componentes. Ele é o resíduo líquido mais abundante gerado nas indústrias de laticínios, que pode levar à poluição dos corpos de água devido as altas demandas bioquímica e química de oxigênio. O permeado de soro de queijo (PS) é um subproduto constituído por lactose, produzido a partir da ultrafiltração do soro. Portanto, o PS pode ser convertido por microrganismos assimiladores de lactose, como leveduras, em produtos de alto valor agregado. A levedura Kluyveromyces marxianus CCT 7735 tem demonstrado um potencial para produzir etanol a partir do açúcar lactose. No entanto, sua baixa tolerância ao etanol é uma desvantagem que precisa ser superada, isto é, seu crescimento é fortemente inibido a partir de 4% de etanol (m/v). A evolução adaptativa em laboratório foi utilizada para selecionar linhagens de K. marxianus CCT 7735 tolerantes ao etanol (ETSs). As ETSs foram crescidas sob estresse por etanol (4%, m/v) por longos períodos de tempo, durante muitas gerações (310-340 números de gerações), a fim de selecionar fenótipos tolerantes ao etanol. A partir da determinação dos parâmetros fisiológicos, as ETSs não apresentaram alterações em suas capacidades fermentativas, quando comparadas as linhagens parentais. A linhagem ETS4 se destacou por apresentar uma taxa específica de crescimento maior que a linhagem parental (acima de 100%) sob estresse por etanol e uma taxa específica de produção de etanol mais elevada dentre todas as linhagens avaliadas neste trabalho. As análises dos perfis de ácidos graxos e metabolômica foram realizadas com as linhagens ETS4 e parental para obter informações sobre os mecanismos relacionados à aquisição de tolerância ao etanol. O acúmulo de alguns aminoácidos (glutamato, alanina, valina, prolina e leucina) e metabólitos do ciclo ácido cítrico (ácido isocítrico, ácido cítrico, ácido cis-aconítico e ácido málico) em ETS4 parece estar associado à aquisição de tolerância ao etanol. Além disso, os altos conteúdos de ácidos graxos e ergosterol na linhagem ETS4 comparado à linhagem parental indicam diferenças entre suas membranas plasmáticas, o que é coerente com o vazamento de metabólitos observado na linhagem parental. Portanto, o acúmulo de aminoácidos e metabólitos do ciclo do ácido cítrico, assim como a alteração nos teores de ácidos graxos e ergosterol contribuíram para a aquisição de tolerância ao etanol em K. marxianus.