Assessment of metabolic regulation and stress response in oleaginous yeasts by systems biology approaches

Abstract

The current environmental crises promoted by the extensive use of oil have highlighted the necessity of alternative and sustainable production chains. Lipids and fatty acids from oleaginous yeasts produced from lignocellulosic hydrolysates are promising sources for oleochemicals. Hence, selecting and developing robust yeast strains that can grow and produce lipids in lignocellulosic hydrolysates is pivotal to broaden their applicability and viability. Lipomyces starkeyi is an oleaginous yeast capable of growing and producing lipids using a diverse range of carbon sources. Its growth and lipid production have been demonstrated in lignocellulosic biomasses. Papiliotrema laurentii can also assimilate sugars derived from agricultural wastes, such as glucose and xylose from lignocellulosic biomasses, and convert them into high lipid amounts. However, wild P. laurentii strains are highly sensitive to acetic acid, one of the primary inhibitors in lignocellulosic hydrolysates. The understanding of multifactorial stress responses and yeast physiology can be facilitated by the application of holistic approaches, including biological networks and high-throughput data. Therefore, we hypothesized that the use of systems biology approaches, including genome-scale metabolic models (GEMs) and transcriptomics, as well as their integration, can support us to understand the metabolism and stress responses of oleaginous yeasts and identify suitable targets for metabolic engineering. Herein, we propose the first GEM of L. starkeyi, lista-GEM. We reconstructed lista-GEM using two high-quality oleaginous yeast models as templates and curated it to reflect the metabolism of L. starkeyi. The simulated phenotypes and predicted flux distributions were in good accordance with experimental data. Then, we predicted targets to improve lipid production in glucose, xylose, and glycerol. Enzymes related to lipid synthesis in the endoplasmic reticulum, such as stearoyl-CoA desaturase, fatty-acyl-CoA synthase, diacylglycerol acyltransferase, and glycerol-3-phosphate acyltransferase, were the main targets to improve lipid production. Glycolytic genes were also predicted as targets for overexpression. Pyruvate decarboxylase, acetaldehyde dehydrogenase, acetyl-CoA synthetase, adenylate kinase, inorganic diphosphatase, and triose-phosphate isomerase were predicted only when glycerol was the carbon source. Hence, lista-GEM provides multiple metabolic engineeringtargets to improve lipid production by L. starkeyi using carbon sources from agricultural and industrial wastes. Furthermore, we combined transcriptome and genome-scale metabolic modeling to deepen our understanding regarding the targets of acetic acid stress, as well as the adaptive responses in P. laurentii. Acetic acid stress promoted global expression changes and most repressed genes were related to transcriptional and translational processes. Under stress, the sensitive strain induced DNA mismatch repair mechanisms and meiosis, while the tolerant strain negatively regulated autophagy and the cell cycle. The tolerant strain induced processes responsible for increasing the intracellular pH (e.g., arginase, ornithine metabolism, urea cycle), detoxification of toxic compounds (e.g., glutathione metabolism), and proton efflux. The tolerant strain also presented a remarkable NAD(P)H pool in the metabolic modeling analysis, which might support the reducing power required by tolerance mechanisms. Otherwise, the sensitive strain induced genes related to cell wall biogenesis and cobalamin synthesis. Overall, the genes and pathways described herein as tolerant-related can be useful in future metabolic engineering strategies to improve the tolerance of P. laurentii to weak acids, boosting its application in lignocellulosic-based biorefineries. Keywords: Metabolic modeling; Transcriptomics; Non-Saccharomyces.As atuais crises ambientais promovidas pelo uso extensivo de petróleo têm realçado a necessidade de cadeias produtivas sustentáveis. Lipídios e ácidos graxos produzidos a partir de hidrolisados lignocelulósicos por leveduras oleaginosas são fontes promissoras de oleoquímicos. Portanto, a seleção e construção de linhagens robustas de leveduras capazes de crescer e produzir lipídios em hidrolisados lignocelulósicos é essencial para ampliar sua aplicação e viabilidade. Lipomyces starkeyi é uma levedura oleaginosa que cresce e produz lipídios a partir de diversas fontes de carbono. O seu crescimento e produção de lipídios já foram demonstrados em biomassas lignocelulósicas. Papiliotrema laurentii também pode assimilar açúcares derivados de subprodutos agrícolas, como a glucose e a xilose de biomassas lignocelulósicas, e convertê-los em elevadas concentrações de lipídios. No entanto, linhagens selvagens de P. laurentii são sensíveis ao ácido acético, um dos principais inibidores presentes em hidrolisados lignocelulósicos. A compreensão das respostas adaptativas e da fisiologia dessas leveduras pode ser facilitada por abordagens holísticas, incluindo redes biológicas e ômicas. Portanto, a nossa hipótese é que o emprego de abordagens de biologia de sistemas, incluindo modelos metabólicos em escala genômica (MMEG) e transcriptômica, bem como a sua integração, pode auxiliar na compreensão do metabolismo e das respostas ao estresse de leveduras oleaginosas e determinação de alvos para a engenharia metabólica. Neste trabalho, propomos o primeiro MMEG de L. starkeyi, lista-GEM. Reconstruímos o lista-GEM usando dois modelos de leveduras oleaginosas de alta qualidade como templates e conduzimos a curadoria manual para refletir o metabolismo de L. starkeyi. Os fenótipos simulados e as distribuições de fluxo previstas apresentaram boa conformidade com os dados experimentais. Em seguida, prevemos alvos para melhorar a produção de lípidos em glicose, xilose e glicerol. As enzimas relacionadas com a síntese de lípidos no retículo endoplasmático, como estearoil- CoA dessaturase, acil-CoA sintase, diacilglicerol aciltransferase e glicerol-3-fosfato aciltransferase, foram os principais alvos para melhorar a produção de lípidos. Genes glicolíticos também foram previstos como alvos de superexpressão. Piruvato descarboxilase,acetaldeído desidrogenase, acetil-CoA sintetase, adenilato quinase, difosfatase inorgânica e triose-fosfato isomerase foram previstas apenas quando o glicerol era a fonte de carbono. Dessa forma, o lista-GEM fornece múltiplos alvos de engenharia metabólica para melhorar a produção de lípidos por L. starkeyi a partir de resíduos agrícolas e industriais. Em seguida, combinamos o transcriptoma e a modelação metabólica em escala genômica para aprofundar o nosso conhecimento sobre os alvos do estresse por ácido acético, bem como sobre as respostas adaptativas de P. laurentii. O ácido acético promoveu alterações globais de expressão e a maioria dos genes reprimidos estava relacionada com processos transcricionais e translacionais. Sob estresse, a linhagem sensível induziu mecanismos de reparo do DNA e meiose, enquanto a linhagem tolerante regulou negativamente a autofagia e o ciclo celular. A linhagem tolerante induziu também processos responsáveis pelo aumento do pH intracelular (ex. arginase, metabolismo da ornitina, ciclo da ureia), detoxificação (ex. metabolismo da glutationa) e efluxo de prótons. A linhagem tolerante também apresentou uma reserva notável de NAD(P)H na análise de modelagem metabólica, o que suportaria o poder redutor exigido pelos mecanismos de tolerância. Por outro lado, a estirpe sensível induziu genes relacionados com a biogênese da parede celular e a síntese de cobalamina. Em geral, os genes e vias aqui descritos como relacionados com a tolerância podem ser úteis em futuras estratégias de engenharia metabólica para melhorar a tolerância de P. laurentii a ácidos fracos, impulsionando a sua aplicação em biorrefinarias baseadas em lignocelulose. Palavras-chave: Modelagem metabólica; Transcriptômica; Não-Saccharomyces.