Caracterização fisiológica de mutantes Kluyveromyces lactis ∆hap1 e ∆rox1 sob aerobiose e hipoxia

Abstract

Na busca de novos resultados para elucidar o papel de HAP1 e ROX1, que codificam um ativador do metabolismo oxidativo e um repressor do metabolismo oxidorredutivo, respectivamente, na levedura Crabtree negativa Kluyveromyces lactis cuja versatilidade metabólica pode ser explorada em vários campos da biotecnologia, inicialmente, foi identificado um gene ortólogo ROX1 à S. cerevisiae na seqüência genômica de K.lactis. O gene KlROX1 possui 40% de identidade daquele presente em S. cerevisiae e um motif característico do domínio HMG (High Mobility Group). Com base nessa seqüência uma linhagem mutante com deleção de ROX1 foi construída e confirmada. O fenótipo URA + e rox1 - dos transformantes obtidos, K.lactis ∆rox1::URA3, foram 100% estáveis sob condição seletiva. O gene putativo ROX1 de K.lactis teve a sua função em resposta ao oxigênio confirmada em culturas de K. lactis sob regime contínuo e desrepressão por glicose, pois, a deleção de ROX1 induziu a um aumento no nível do transcrito do gene hipóxico HEM13. A análise dos produtos do metabolismo permitiu inferir que a deleção do gene ROX1 em K. lactis aumentou a capacidade fermentativa dessa levedura sob aerobiose e de desrepressão catabólica. A investigação em culturas K. lactis ∆hap1 submetidas ao cultivo contínuo aeróbico sob desrepressão por glicose revelou um fenótipo relacionado ao metabolismo oxidorredutivo, ou seja, K. lactis ∆hap1 é mais fermentativa levando a diversidade de metabólitos em torno do piruvato. A proposta da via de regulação parcial negativa controlando a expressão de HEM13 foi confirmada nas culturas K. lactis.The objective of this study was to search for new results in order to elucidate the role of HAP1 and ROX1, which codify an oxidative metabolism activator and an oxidoreductive metabolism repressor respectively, in the Crabtree-negative yeast Kluyveromyces lactis, whose metabolic versatility can be exploited in several biotechnology fields. Initially, a ROX1 gene orthologous to S. cerevisiae was identified in the genomic sequence of K. lactis. The KlROX1 gene has 40% identity with the one present in S. cerevisiae and a characteristic motif of the HMG (High Mobility Group) domain. Based on this sequence, a mutant line with ROX1 deletion was built and confirmed. The obtained transformant URA + and rox1 - phenotypes, K. lactis ∆rox1::URA3, were 100% stable under selective condition. The putative K. lactis ROX1 gene had its function in response to oxygen confirmed in cultures of K. lactis under continuous regime and glucose derepression, since ROX1 deletion induced an increase in the level of the HEM13 hypoxic gene transcript. The analysis of metabolism products allowed inferring that the deletion of gene ROX1 in K. lactis increased the yeast fermentative capacity under aerobic and catabolic derepression. The investigation in K. lactis ∆hap1 cultures under continuous aerobic cultivation and glucose derepressiom revealed a phenotype related to oxidoreductive metabolism, in other words, K. lactis ∆hap1 is more fermentative, leading to metabolite diversity around the piruvate. The proposal of the partial negative regulation pathway controlling the HEM13 expression was confirmed in K. lactis cultures.