Bioquímica Aplicada
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Item Desvendando o secretoma do fungo fitopatogênico Chrysoporthe cubensis LPF-1 cultivado em biomassa lignocelulósica como potencial fonte de enzimas para produção de bioetanol(Universidade Federal de Viçosa, 2019-07-08) Tavares, Murillo Peterlini; Guimarães, Valéria Monteze; http://lattes.cnpq.br/0505206837779243A crescente preocupação com a escassez de combustíveis fósseis e o aumento da emissão de gases do efeito estufa, tem resultado no aumento do interesse em nível global por fontes de energia alternativas que sejam sustentáveis. Esforços têm sido feitos para atingir esses objetivos, como o desenvolvimento de tecnologias que utilizam a biomassa de resíduos agroindustriais para a produção de biocombustíveis. Nesse contexto, o Brasil se destaca como o maior produtor de cana-de-açúcar do mundo. A utilização da biomassa lignocelulósica proveniente do bagaço de cana-de-açúcar para a produção de etanol de segunda geração torna-se uma alternativa promissora para a redução dos impactos ambientais provenientes do uso de combustíveis fósseis. Considerando o processo de conversão bioquímica de biomassa em etanol, a hidrólise enzimática é normalmente referida como a etapa limitante, devido ao custo elevado de enzimas comerciais. Dessa forma, o desenvolvimento de bioprocessos para produção das enzimas on-site e estratégias para aumentar o rendimento final da hidrólise enzimática são necessários para assegurar que a conversão de biomassa se torne financeiramente viável em etapas de produção em larga escala. Uma vez que o extrato enzimático do fungo fitopatogênico Chrysoporthe cubensis LPF-1 apresentou elevada eficiência para sacarificação da biomassa lignocelulósica em diferentes abordagens, tornou-se essencial conhecer detalhadamente as enzimas e proteínas secretadas por este fungo, especialmente aquelas envolvidas na hidrólise de biomassa. Para tanto, o objetivo deste trabalho foi caracterizar pela primeira vez os perfis proteicos produzidos e secretados por C. cubensis crescido em estado semi-sólido tendo o farelo de trigo ou bagaço de cana-de açúcar como fontes de carbono, e realizar a integração de predições in silico obtidas por ferramentas computacionais com os dados de proteômica obtidos por espectrometria de massas. A integração dos resultados computacionais com os dados proteômicos possibilitou o aumento da identificação das proteínas secretadas e a previsão de todo o potencial de secreção do fungo que pode ser induzido por outras fontes de carbono ou condições de cultivo, evidenciando seu real potencial como microrganismo produtor de lignocelulases. O presente trabalho demonstrou que C. cubensis foi capaz de secretar um maior número e variedade de enzimas ativas em carboidratos do que microrganismos reconhecidamente consideradas excelentes fontes de enzimas industriais, como os fungos do gênero Aspergillus e Penicillium. Também foi observado que C. cubensis apresentou composição do secretoma com características exclusivas de acordo com a fonte de carbono ao qual foi cultivado, revelando uma grande plasticidade no perfil de secreção enzimática do fungo. C. cubensis é capaz de produzir diferentes coquetéis enzimáticos eficientes que podem ser aplicados em uma variedade de biomassas lignocelulósica com características distintas, o que normalmente não é encontrado em produtos comerciais que possuem composição definida e aplicação restrita às biomassas comumente utilizadas. Além disso, C. cubensis foi capaz de secretar famílias de enzimas que têm sido extensivamente estudadas como alvos de grande interesse biotecnológico, como as oxidases de multi- cobre (MCOs). C. cubensis foi capaz de secretar duas MCOs quando cultivado em uma mistura de farelo de trigo e casca de laranja na proporção 3:1. A fração purificada contendo as duas MCOs catalisou a oxidação dos compostos fenólicos produzidos pelo pré-tratamento alcalino do bagaço de cana-de-açúcar, o que resultou em melhores rendimentos de sacarificação deste material, demonstrando serem enzimas promissoras para aplicações em hidrólise de biomassa e de grande potencial biotecnológico. Dessa forma, C. cubensis emerge como alternativa promissora para a produção de enzimas lignocelulolíticas clássicas e como fonte de novos alvos enzimáticos para a indústria de bioetanol.Item Microbiota associada à Tetranychus spp. (Acari: Tetranychidae) em tomateiro e a resposta bioquímica defensiva dessa planta à herbivoria de pragas agrícolas(Universidade Federal de Viçosa, 2015-11-27) Ribeiro, Fabricio Rainha; Oliveira, Maria Goreti de Almeida; http://lattes.cnpq.br/2639783219310404O Brasil é um dos maiores produtores de tomateiro do mundo, apresentando assim importante papel na economia do país. Como toda monocultura, o tomateiro não está livre de herbívoros-praga, entre as quais se destacam os ácaros Tetranychus urticae (KOCH, 1836) e T. evansi (ácaro-vermelho) e a largata Tuta absoluta (Meyrick, 1917). Visando defenderem-se das injúrias causadas por herbívoros, as plantas possuem diversas estratégias de defesa. Uma delas são as alterações na expressão de seus genes que elevam os níveis de compostos de defesa. Em contrapartida aos mecanismos de defesa desenvolvidos pelas plantas, os insetos tendem a se adaptar e/ou burlar os compostos desta defesa. Isso pode ocorrer através do aumento da síntese de enzimas proteolíticas do intestino dos insetos ou por meio de associação com endossimbiontes. Assim, este trabalho visou identificar a diversidade microbiana em T. evansi e T. urticae, as possíveis interferências da associação microbiana de T. evansi sobre a defesa do tomateiro, além de estudar a resposta de defesa induzida da planta quando submetida, simultaneamente, a diferentes herbívoros e às atividades enzimáticas dos herbívoros quando alimentados com folhas destas plantas. Por fim, foi avaliado o efeito da defesa do tomateiro na reprodução de T. evansi. Primeiramente foi determinada mediante técnica de eletroforese e gel com gradiente desnaturante (DGGE), a diversidade de micro- organismos, fungos e bactérias, associados a T. evansi e T. urticae. Além disso, avaliou-se primers específicos para identificação de Wolbachia, Rickettsia, Spiroplasma e Cardinium. Os ácaros não apresentaram associação endossimbiótica com fungos. T. evansi possui maior diversidade bacteriana que T. urticae, sendo predominantemente diferentes as espécies de bactérias entre estes ácaros. As maiorias das bactérias encontradas nos ácaros são do filo Proteobactéria e algumas ainda não foram identificadas. Não foi possível a identificação específica das bactérias com os primeres utilizados. Este é o primeiro trabalho sobre a diversidade vide micro-organismos nessas duas importantes espécies de ácaros. Em outra etapa da pesquisa foi instalado um experimento com os seguintes tratamentos: plantas sem herbívoros; plantas infestadas com T. evansi; plantas infestadas por T. evansi tratados com tetraciclina; plantas infestadas por T. urticae; plantas infestadas por T. evansi + T. urticae; plantas infestadas por T. evansi + T. absoluta; plantas infestadas por T. urticae + T. absoluta; e plantas infestadas por T. absoluta. Para análise da defesa do tomateiro foram avaliadas as atividades de lipase, lipoxigenase (LOX), inibidores de proteases (IP) e polifenoloxidase (PPO). Foram avaliados os efeitos desses compostos de defesa sobre a oviposição de T. evansi. Nos herbívoros, foram feitas análises de atividade de proteases totais, atividade amidásica de tripsina-like, atividade esterásica de tripsina-like, atividade de quimiotripsina-like e cisteíno protease. Essas análises foram feitas em T. evansi, T. urticae, T. absoluta, T. evansi quando a planta foi injuriada por T. evansi e T. urticae juntos e em T. evansi quando atacou a planta com T. absoluta. T. evansi não tratado com tetraciclina não induziu a via de defesa do tomateiro que resulta na produção de IP, embora sua injuria tenha induzido uma maior atividade de PPO, isso não afetou sua oviposição. T. evansi tratado com tetraciclina induziu parcialmente a defesa do tomateiro. Quando esse ácaro injuriou o tomateiro com outros herbívoros, os níveis de IP do tomateiro foram aumentados. Todos os herbívoros possuem atividades para as enzimas digestivas testadas, sendo que para T. evansi tratado com tetraciclina ocorreu uma diferença na atividade de quimiotripsina-like e na atividade de tripsina-like. Estes resultados demostram que possivelmente bactérias endossimbiontes podem auxiliar o ácaro T. evansi a contornar as defesas do tomateiro. O tomate consegue responder ao T. evansi quando esse ataca o tomateiro simultaneamente com outros herbívoros e que as bactérias endossimbiontes de T. evansi alteram as atividades de suas enzimas digestivas.Item Produção de xilooligossacarídeos por xilanase fúngica recombinante imobilizada(Universidade Federal de Viçosa, 2022-07-29) Fernandes, Letícia Persilva; Alfenas, Gabriela Píccolo Maitan; http://lattes.cnpq.br/2470609087080753A endoxilanase é uma enzima que hidrolisa a cadeia de xilana formando xilooligossacarídeos (XOS) menores que são ingredientes prebióticos com potencial aplicação nas indústrias de alimentos e farmacêutica. Entretanto, o uso de enzimas na indústria pode ser limitado devido ao seu alto custo; portanto, faz-se necessário o uso de metodologias como a imobilização, que torna possível a recuperação da enzima, sua reutilização e melhora das características físico- químicas enzimáticas, de acordo com o processo desejado. O objetivo deste trabalho foi produzir XOS por uma xilanase fúngica engenheirada imobilizada. Para isso, a xilanase do fungo Orpinomyces sp., SM2, foi expressa em Escherichia coli e, após a expressão, foi realizada a imobilização do extrato bruto diluído 100 vezes pela metodologia de cross-linking com isopropanol 80 % e glutaraldeído 1 %. Então, fez-se o ensaio de pH ótimo, temperatura ótima e a termoestabilidade a 50 ºC, para comparação das formas livre e imobilizada da enzima. Foi aplicado 1 U do agregado enzimático na sacarificação do farelo de arroz pré-tratado alcalinamente com NaOH 1 %. Alíquotas foram coletadas para a avaliação do perfil dos XOS. Por fim, realizou-se o teste de reutilização da enzima imobilizada na temperatura de 50 ºC, por 10 ciclos, e o ensaio de armazenamento por 15 dias em temperatura ambiente e à 4 ºC. O rendimento de imobilização foi de 1,48 %. A enzima imobilizada obteve melhor atividade na faixa de pH ácida para neutra, sendo 5 o seu pH de máxima atividade; enquanto que a enzima livre apresentou melhor desempenho na faixa básica e seu pH ótimo foi 8. A temperatura ótima foi de 60 ºC para as duas enzimas, porém a xilanase imobilizada apresentou melhor estabilidade em uma faixa maior de temperatura. O tempo de meia vida da xilanase SM2 imobilizada foi de 216 horas e o da enzima livre de 30 horas. No ensaio de sacarificação, após 96 horas, houve a produção de 0,903 ± 0,013 g/L de xilobiose, 0,487 ± 0,000 g/L de xilotriose e 0,809 ± 0,006 g/L de xiloexose pela enzima imobilizada. Para o teste de reutilização, a atividade enzimática aumentou a cada ciclo, e no ensaio de armazenamento não houve diferença estatística nas atividades enzimáticas para as duas condições testadas. Portanto, conclui-se que apesar do baixo rendimento de imobilização da xilanase SM2, este processo melhorou a estabilidade da enzima, tornando-a mais estável em temperaturas mais altas, e aumentando o tempo de meia vida para mais de 7 vezes em comparação com a xilanase livre no ensaio de termoestabilidade. Na sacarificação, mesmo com uma concentração baixa de xilanase imobilizada, houve hidrólise do farelo de arroz pré-tratado, com liberação de XOS. Por fim, foi demonstrado que a enzima imobilizada pode ser reutilizada por mais de 10 ciclos, e como não houve diferença entre as duas formas de armazenamento, sugere-se que não há necessidade de refrigeração para manutenção da atividade da xilanase imobilizada. Palavras-chave: Xilanase. Expressão heteróloga. Imobilização. Xilooligossacarídeos.Item Defesa bioquímica de plantas às pragas agrícolas: desenho racional de inibidores de proteases peptídicos a serem utilizados nas formulações biopesticidas(Universidade Federal de Viçosa, 2022-05-27) Barros, Rafael de Almeida; Oliveira, Maria Goreti de Almeida; http://lattes.cnpq.br/2860273646340733Os danos causados por insetos lepidópteros reduzem o rendimento e a qualidade das lavouras de soja devido à desfolha, impactando negativamente os lucros da agricultura. Para controlar essas pragas, muitos produtores de soja recorrem a grandes quantidades de agrotóxicos sintéticos e cultivares transgênicos contendo toxinas Bt. Os agrotóxicos sintéticos comumente utilizados, além de refratários, impactando negativamente o meio ambiente, muitas vezes estão relacionados a problemas de saúde humana. Além disso, a pressão seletiva em herbívoros causada pelo uso de um modo de ação único, como proteínas tóxicas de cultivares Bt transgênicas, gera pragas resistentes. Por isso, a busca por compostos biológicos ecologicamente corretos, com diferentes modos de ação e efeitos semelhantes aos dos agrotóxicos convencionais, tem ganhado atenção em todo o mundo devido ao seu apelo sustentável. Os inibidores de protease (IPs) fazem parte da defesa natural das plantas contra herbívoros e aparecem como um potencial agente de controle para complementar, ou mesmo substituir, os atuais agrotóxicos convencionais. Essas moléculas se ligam a proteases que clivam as proteínas da dieta em aminoácidos livres, prejudicando o ciclo de vida e a reprodução dos insetos. No entanto, devido à coevolução com as plantas, os herbívoros desenvolveram adaptações para retardar os efeitos dos IPs naturais, reduzindo sua eficácia no campo. Neste trabalho, primeiramente, foram avaliados os efeitos de dois inibidores de proteases peptídicos (GORE1 e GORE2) desenhados a partir de substratos tripeptídicos de tripsina-like contra Anticarsia gemmatalis através de estudos de docking e dinâmica molecular, ensaios enzimáticos in vitro e in vivo e testes biológicos. Posteriormente, foram avaliados os efeitos diferenciais de dois inibidores de proteases BPTI (Bovine pancreatic trypsin inhibitor) – non-host PI e SKTI (Soybean kunitz trypsin inhibitor) – host PI – nas respostas adaptativos e no ciclo de vida de Anticarsia gemmatalis. Além disso, foram realizados ensaios computacionais de dinâmica molecular proteína- proteína a fim de identificar os sítios reativos destas duas moléculas, visando o desenho de outros novos peptídeos inibidores de proteases. Os inibidores peptídicos são potenciais candidatos para o manejo de insetos lepidópteros. A otimização dessas moléculas, por meio de modificações químicas estruturais, e a formulação de biopesticidas contendo uma variedade de peptídeos, com diferentes modos de ligação a serino-proteases, poderia viabilizar o uso desse tipo de moléculas na agricultura. Palavras-chave: Lagarta-da-soja. Peptídeos. Inibidores proteicos. Serino-proteases. Docking molecularItem Transcriptoma, proteoma e cinética das proteases intestinais de lagarta da soja: características da resposta bioquímica a inibidores de proteases de natureza proteica(Universidade Federal de Viçosa, 2022-06-20) Silva Júnior, Neilier Rodrigues da; Oliveira, Maria Goreti de Almeida; http://lattes.cnpq.br/6118347723704489Os inibidores de protease (IP) produzidos pelos vegetais têm um amplo espectro de proteases- alvo. No entanto, as pragas agrícolas encontraram formas de debelar os efeitos negativos dos IP de suas plantas hospedeiras. Para compreender os mecanismos moleculares e fisiológicos envolvidos na interação inseto-planta, a lagarta da soja (Anticarsia gemmatalis) e a soja (Glycine max) foram utilizadas como animal e planta modelo. Por meio de diferentes abordagens bioquímicas e biológicas, este trabalho apresentou as hidrolases intestinais da A. gemmatalis com elevada cobertura mediante à metodologia de 1DE-LC/MS proposta. Essa estratégia, apresentada de forma inédita, possibilitou a identificação de 98 hidrolases não redundantes, compreendendo isoformas importantes no mecanismo adaptativo do inseto a IP de plantas. As variações ocorridas nesse proteoma foram avaliadas expondo a lagarta a IP. Os resultados mostraram modulações fisiológicas que foram capazes de driblar os efeitos negativos dos inibidores. Houve aumento de isoformas responsáveis por atividades proteolíticas bem como aumento de proteínas relacionadas a processos de estresse. A presença de IP na dieta causou respostas nas atividades enzimáticas que revelaram uma melhor adaptação da lagarta ao IP natural da soja quando comparado a inibidores sintéticos. As análises de docking molecular mostraram a termodinâmica e os sítios de ligação envolvidos no complexo enzima-inibidor (EI), revelando características importantes para um IP eficiente. Usando esse conhecimento como base, um tripeptídeo (GORE2) foi racionalmente desenhado para atuar como inibidor de tripsinas-like de A. gemmatalis. O transcriptoma do intestino da lagarta mostrou que a presença do GORE2 e do SKTI, inibidor natural da soja, foram responsáveis por 1474 genes diferencialmente expressos, revelando importantes enzimas envolvidas na resposta do inseto. O GORE2 proposto mostrou-se mais eficiente que o SKTI ao provocar danos celulares no epitélio intestinal. Os danos mais intensos e extensos provocados pelo inibidor peptídico foram acompanhados por estresse oxidativo e pela baixa eficiência na resposta do inseto para se desintoxicar do estresse oxidativo por meio de enzimas antioxidantes. Esses resultados permitiram um melhor entendimento sobre o arsenal bioquímico e molecular do herbívoro para propor um IP potente, abrindo caminho para novas abordagens no desenvolvimento de defensivos agrícolas ambientalmente corretos e eficientes no manejo de pragas. Palavras-chave: Anticarsia gemmatalis. Enzimologia. Glycine max. Manejo de pragas agrícolas. Proteômica.Item Avaliação do potencial de aplicação industrial de subprodutos da cadeia produtiva das palmeiras amazônicas Açaí (Euterpe oleracea), Tucumã do Amazonas (Astrocaryum aculeatum) e Tucumã do Pará (Astrocaryum vulgare)(Universidade Federal de Viçosa, 2021-08-30) Santos, Kimberly Luciana Beira-Mar dos; Guimarães, Valéria Monteze; http://lattes.cnpq.br/1191165975709933O crescente aumento demográfico associado à demanda por insumos e energia é uma preocupação mundial. Várias estratégias estão sendo desenvolvidas visando mitigar os efeitos do consumo de recursos não-renováveis, uma delas é o uso de biomassas vegetais, que surgem como uma alternativa limpa, sustentável e abundante. O objetivo deste trabalho foi avaliar o potencial de aplicação industrial de subprodutos das cadeias produtivas de biomassas amazônicas como o açaí, tucumã do Amazonas e tucumã do Pará. Ensaios de caracterização química destas biomassas amazônicas permitiram compreender a composição e a grande biodisponibilidade de moléculas de interesse biotecnológico, como polissacarídeos, lignina, proteínas e lipídios. Baseado na composição rica em nutrientes, a casca de tucumã do Amazonas in natura e a fibra da polpa de tucumã do Pará, foram avaliadas quanto ao seu potencial como fonte de carbono na indução de enzimas lignocelulolíticas utilizando cinco fungos conhecidos pela sua produção de (hemi)celulases, são eles: Aspergillus niger, Penicillium chrysogenum, Chrysoporthe cubensis, Trichoderma deliquescens e Ceratocystis fimbriata. Os resultados mostraram que ambas as biomassas são excelentes fontes de carbono, no entanto os extratos enzimáticos mais completos em termos de atividade enzimática e quantidade de enzimas foi produzido pelos fungos C. cubensis e T. deliquescens cultivados na casca de tucumã do Amazonas. Além disso, ensaios de hidrólise enzimática das biomassas foram realizados utilizando os extratos enzimáticos brutos de C. cubensis e T. deliquescens e o coquetel comercial CellicCTec 2. Os melhores resultados de liberação de glicose foram alcançados na hidrólise da fibra polpa de tucumã do Pará processada pelos coquetéis de C. cubensis e T. deliquescens. As análises experimentais permitiram concluir que a biodisponibilidade das biomassas aqui estudadas pode ser a chave para o desenvolvimento regional sustentável, pois permite que os recursos naturais sejam completamente aproveitados de forma racional e consciente, mas também gerando retorno econômico e desenvolvimento social. Palavras-chave: Açaí. Tucumã do Amazonas. Tucumã do Pará. Caracterização química. Hidrólise enzimáticaItem Atividade nematicida in vitro de micélios e extratos de Fusarium verticillioides e Pleurotus djamor(Universidade Federal de Viçosa, 2020-09-30) Tavares, Gabriella Peterlini; Queiroz, José Humberto de; http://lattes.cnpq.br/9080290215531607Os nematoides do gênero Meloidogyne são responsáveis por enormes prejuízos na agricultura, sendo considerados os principais fitopatógenos devido ao seu modo de vida endoparasitário. Ao infectar as raízes provocam sérios danos que culminam na perda de produtividade no campo. Como alternativa para controlar essa praga agrícola sem prejudicar a saúde humana e o meio ambiente, fungos nematófagos são muito utilizados, sendo considerados inimigos naturais dos nematoides. Este trabalho tem por objetivo investigar os fungos Fusarium verticillioides e Pleurotus djamor como agentes de biocontrole. Foram testadas as atividades do micélio, do extrato bruto e da protease parcialmente purificada provenientes de um isolado de F. verticillioides sobre juvenis de Meloidogyne javanica. A punficação enzimática ocorreu por meio de ultrafiltração seguida de cromatografia de troca iônica. Obteve-se um pool enzimático com um fator de purificação de 19,79 vezes e um rendimento de 1,58% que apresentou maior atividade proteolítica a 50ºC em pH 9. A protease parcialmente purificada se mostrou termoestável a 50ºC, mantendo atividade relativa superior a 50% durante 60 horas nessa temperatura. A atividade enzimática foi inibida em presença de SDS e PMSF, características associadas a serino proteases. A atividade nematicida de F verticillioides foi observada após 24h de tratamento com micélio, extrato bruto e protease parcialmente purificada, os quais promoveram redução (p < 0,01) de 71,26 %, 61,48 e 84,81% na quantidade de juvenis J2 de M. javanica vivos, respectivamente. Os resultados obtidos demonstram F. verticillioides é um organismo promissor no controle biológico de fitonematóides e seu mecanismo de ação se dá pela produção de proteases degradadoras de cutícula. Também foi avaliada a atividade nematicida do micélio de P. djamor. Na presença dos micélios houve redução (p <0,01) das formas ativas de P. redivivus em 44,61% e 86,79% após tratamento de 24 e 48 horas. Sobre M. incognita houve a redução (p < 0,01) das formas ativas de J2 em 47,42% e 50,23% nos mesmos intervalos de tempo, no entanto não se observou atividade dos micélios sobre a integridade da estrutura dos ovos. O extrato aquoso e o extrato hidroalcoólico também se mostraram eficazes sobre P. redivivus. Durante os ensaios in vitro observou-se a formação de vesículas tóxicas com atividade nematicida. Também foi possível evidenciar a penetração dos micélios fúngicos na cutícula dos nematoides após a imobilização, fato que sustenta a inclusão de P. djamor como um fungo nematófago. Palavras-chave: Biocontrole. Fungos. Nematicida.Item Utilização de resíduos agroindustriais no controle biológico de Meloidogyne incognita na soja(Universidade Federal de Viçosa, 2020-02-28) Oliveira, Stella Pollyanne; Queiroz, José Humberto deOs nematoides parasitam homens, animais e vegetais. Os fitonematoides são pragas responsáveis por perdas de produção significativa na agricultura, estimada em cerca de U$ 100 bilhões de dólares ao ano. A cultura de soja é uma das mais afetadas por esses fitopatógenos, estima-se perdas de 30 a 50% por safra. Os nematoides mais frequentes e prejudiciais tem sido os do gênero Me- loidogyne sp ., conhecidos como nematoides formadores de galhas, causam perdas econômicas em praticamente todas as espécies de plantas cultivadas. Diversas estratégias podem ser empregadas no manejo de nematoides na cultura, entretanto os nematicidas podem causar danos ambientais e à saúde humana. Diante dessas circunstâncias o controle biológico tem ganhado força, dentre eles se destacam os fungos nematófagos, que estão presentes na natureza como antagonistas naturais e conhecidos como agentes destruidores de nematoides. O que confere a ação nematicida desses fungos é que além de poderem parasita-los diretamente através de suas hifas, secretam metabolitos e enzimas com atividade nematicida. Trabalhos recentes do nosso grupo de pesquisa demonstraram que resíduos da produção de cogumelos apresentam um grande potencial nematicida. Estes resultados geraram o pedido de patente número BR10201801585, desde modo avaliou-se a atividade nematicida dos resíduos fungicos in vitro e in vivo contra o M. incognita e estimou-se a atividade enzimática de proteases e quitinases presentes nos resíduos. Elevadas taxas de mortalidades de ovos/juvenis foram observadas na avaliação in vitro , sendo os quatro melhores fungos H. mamoreus, L. edodes, P. ostreatus e P. eryngii testados in vivo , em casa de vegetação. Esses resíduos resultaram em altas taxas de redução no índice de galhas, ovos e juvenis, chegando a 70%, 69,4% e 52%, respectivamente. Além de reduzir a população de nematoides, os fungos diminuíram os danos causados por estes, aumentando a altura e massa da parte aérea, a produção de vagens e a massa fresca da raiz. A aná- lise enzimática demonstrou a presença de quitinases em todos os resíduos.Através dos resultados, pode-se constatar uma alta atividade nematicida dos resíduos de cogumelos, bem como a presença de quitinases. Isso indica que é muito importante uma caracterização dos compostos presentes nesses resíduos e entender melhor a interação de cada fungo com a planta e o nematoide. Palavras-chave: Fitonematoides. Controle biológico. Basidiomicetos. Metabolitos.Item Análise de extratos fúngicos relacionados ao controle biológico de fitonematoides e à promoção de crescimento vegetal(Universidade Federal de Viçosa, 2018-02-23) Gouveia, Angélica de Souza; Queiroz, José Humberto de; http://lattes.cnpq.br/9934730476930921O uso de fungos nematófagos tem sido mais investigado nos últimos anos por ser uma alternativa ecológica e eficiente no manejo integrado de nematoides. O potencial nematófago do Monacrosporium thaumasium foi verificado por meio da produção de compostos extracelulares com atividade nematicida. O extrato bruto obtido da fermentação sólida utilizando-se farelo de trigo foi fracionado e uma fração com atividade nematicida foi identificada. Os mesmos procedimentos foram efetuados para o tratamento testemunha, que não possuía o inóculo fúngico e obtiveram-se duas frações com atividade nematicida. Essas frações foram analisadas via espectrometria de massas e foi constatada similaridade entre o perfil das massas. Desse modo, não foi possível identificar compostos específicos da fração referente ao extrato fúngico e, provavelmente, o efeito nematicida é oriundo dos compostos do farelo de trigo. Também foram avaliados alguns compostos extracelulares produzidos por diferentes isolados do fungo Pochonia chlamydosporia (PC). Essa espécie é descrita por sua ação no controle biológico de fitonematoides e por promover o crescimento vegetativo. A produção de proteases foi verificada nos diferentes isolados e para o isolado PC-40 foi identificada a produção da protease subtilisina-like. A promoção de crescimento pode ser resultado de maior disponibilização de fosfato para a planta. Desse modo, a solubilização de fosfato por diferentes isolados de P. chlamydosporia foi avaliada em meio líquido e sólido confirmando-se a capacidade de solubilização por esses. Os isolados também foram aptos à produção de fosfatases extracelulares que podem auxiliar na liberação de fosfato de fontes orgânicas. Outro composto que pode contribuir para o desenvolvimento de plantas é o fitohormônio auxina, secretado pelos isolados PC-10 e PC-46 e detectado via LC/MS-MS. Através dos resultados, pode-se constatar que não são todos os isolados capazes de produzir auxina, bem como a existência de uma forte plasticidade na produção de diferentes compostos. Isso indica que é muito importante um screening inicial de isolados a fim de selecionar o ideal agente de controle biológico e/ou promotor de crescimento vegetal.Item Análise proteômica comparativa do intestino de Anticarsia gemmatalis em resposta a inibidores de proteases(Universidade Federal de Viçosa, 2017-02-24) Coura, Roberta Ribeiro; Oliveira, Maria Goreti de Almeida; http://lattes.cnpq.br/0182455179210454A lagarta-da-soja, Anticarsia gemmatalis, é considerada uma das principais pragas da cultura da soja. Os danos causados pelo ataque deste inseto associado à relevância econômica do cultivo da soja para o Brasil e para o mundo fomentam a busca por alternativas no controle deste inseto. Estratégias de controle de insetos-pragas baseadas no uso de inibidores de proteases têm sido estudadas, o conhecimento das enzimas digestivas e metabolismo do inseto tem se mostrado fundamental. Neste contexto, este trabalho teve como objetivo identificar proteínas com abundância diferencial no intestino de A. gemmatalis em resposta a inibidor de protease, visando obter dados que poderão contribuir para esclarecer o mecanismo adaptativo de A. gemmatalis em resposta a inibidores de proteases na interação planta-inseto. Foram dissecados intestinos de lagartas alimentadas com os inibidores de proteases berenil e o Kunitz, nas horas 6 h, 12 h, 24 h e 48 h e as proteínas extraídas por maceração. Os spots com abundância diferencial foram digeridos e os peptídeos analisados no espectrômetro de massa MALDI/TOF-TOF. Os espectros (MS/MS) foram pesquisados em bancos de dados usando a ferramenta MASCOT e as proteínas identificadas foram validadas usando o software Scaffold. Foram 44 spots de proteínas identificados, nos tratamentos com os inibidores berenil e Kunitz, nas diferentes horas, que correspondeu a 33 proteínas distintas. As proteínas identificadas pertenciam a diferentes categorias funcionais envolvidas no metabolismo energético, do carbono, de aminoácido, de carboidratos, de lipídeos, no estresse oxidativo e no turnover proteico e chaperonas moleculares. Algumas isoformas da proteína ATPase apresentaram menor abundância em relação ao controle, em ambos tratamentos. Enquanto a maioria das proteínas de choque térmico 70 apresentaram maior abundância que o controle. As proteínas piruvato desidrogenase, fosfoglicerato mutase e a ATP sintase aumentaram abundância e as proteínas aldeído desidrogenase e carbonil redutase diminuíram abundância no tratamento com berenil. No tratamento com Kunitz as proteínas arginina quinase e a choque térmico Hsp 90 aumentaram a abundância enquanto as proteínas enoil-CoA hidratase, ATP sintase e a aspartato aminotransferase diminuíram a abundância. A presença dos inibidores berenil e Kunitz na lagarta A. gemmatalis alterou o perfil de proteínas no intestino em ambos tratamentos.
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