Desvendando o secretoma do fungo fitopatogênico Chrysoporthe cubensis LPF-1 cultivado em biomassa lignocelulósica como potencial fonte de enzimas para produção de bioetanol

Abstract

A crescente preocupação com a escassez de combustíveis fósseis e o aumento da emissão de gases do efeito estufa, tem resultado no aumento do interesse em nível global por fontes de energia alternativas que sejam sustentáveis. Esforços têm sido feitos para atingir esses objetivos, como o desenvolvimento de tecnologias que utilizam a biomassa de resíduos agroindustriais para a produção de biocombustíveis. Nesse contexto, o Brasil se destaca como o maior produtor de cana-de-açúcar do mundo. A utilização da biomassa lignocelulósica proveniente do bagaço de cana-de-açúcar para a produção de etanol de segunda geração torna-se uma alternativa promissora para a redução dos impactos ambientais provenientes do uso de combustíveis fósseis. Considerando o processo de conversão bioquímica de biomassa em etanol, a hidrólise enzimática é normalmente referida como a etapa limitante, devido ao custo elevado de enzimas comerciais. Dessa forma, o desenvolvimento de bioprocessos para produção das enzimas on-site e estratégias para aumentar o rendimento final da hidrólise enzimática são necessários para assegurar que a conversão de biomassa se torne financeiramente viável em etapas de produção em larga escala. Uma vez que o extrato enzimático do fungo fitopatogênico Chrysoporthe cubensis LPF-1 apresentou elevada eficiência para sacarificação da biomassa lignocelulósica em diferentes abordagens, tornou-se essencial conhecer detalhadamente as enzimas e proteínas secretadas por este fungo, especialmente aquelas envolvidas na hidrólise de biomassa. Para tanto, o objetivo deste trabalho foi caracterizar pela primeira vez os perfis proteicos produzidos e secretados por C. cubensis crescido em estado semi-sólido tendo o farelo de trigo ou bagaço de cana-de açúcar como fontes de carbono, e realizar a integração de predições in silico obtidas por ferramentas computacionais com os dados de proteômica obtidos por espectrometria de massas. A integração dos resultados computacionais com os dados proteômicos possibilitou o aumento da identificação das proteínas secretadas e a previsão de todo o potencial de secreção do fungo que pode ser induzido por outras fontes de carbono ou condições de cultivo, evidenciando seu real potencial como microrganismo produtor de lignocelulases. O presente trabalho demonstrou que C. cubensis foi capaz de secretar um maior número e variedade de enzimas ativas em carboidratos do que microrganismos reconhecidamente consideradas excelentes fontes de enzimas industriais, como os fungos do gênero Aspergillus e Penicillium. Também foi observado que C. cubensis apresentou composição do secretoma com características exclusivas de acordo com a fonte de carbono ao qual foi cultivado, revelando uma grande plasticidade no perfil de secreção enzimática do fungo. C. cubensis é capaz de produzir diferentes coquetéis enzimáticos eficientes que podem ser aplicados em uma variedade de biomassas lignocelulósica com características distintas, o que normalmente não é encontrado em produtos comerciais que possuem composição definida e aplicação restrita às biomassas comumente utilizadas. Além disso, C. cubensis foi capaz de secretar famílias de enzimas que têm sido extensivamente estudadas como alvos de grande interesse biotecnológico, como as oxidases de multi- cobre (MCOs). C. cubensis foi capaz de secretar duas MCOs quando cultivado em uma mistura de farelo de trigo e casca de laranja na proporção 3:1. A fração purificada contendo as duas MCOs catalisou a oxidação dos compostos fenólicos produzidos pelo pré-tratamento alcalino do bagaço de cana-de-açúcar, o que resultou em melhores rendimentos de sacarificação deste material, demonstrando serem enzimas promissoras para aplicações em hidrólise de biomassa e de grande potencial biotecnológico. Dessa forma, C. cubensis emerge como alternativa promissora para a produção de enzimas lignocelulolíticas clássicas e como fonte de novos alvos enzimáticos para a indústria de bioetanol.The growing worldwide concern over the shortage of fossil fuels and the increase in emissions of greenhouse gases have resulted in an increased global interest for sustainable and alternative energy sources. Efforts have been made to achieve these goals, such as the development of technologies that use biomass from agricultural residues for the production of biofuels. In this context, Brazil stands out as the largest producer of sugarcane in the world. The use of lignocellulosic biomass from the sugarcane bagasse for second-generation ethanol becomes a promising alternative for the reduction of environmental impacts from the use of fossil fuels. Concerning the biochemical process of converting biomass to ethanol, the enzymatic hydrolysis is usually referred to be the limiting step because of the high cost of commercial enzymes. Thus, the development of bioprocesses for the production of on-site enzymes and strategies to increase the final yield of enzymatic hydrolysis are necessary to ensure that biomass conversion becomes financially feasible in large-scale production steps. Since the enzymatic extract of the phytopathogenic fungus Chrysoporthe cubensis LPF-1 showed high efficiency for saccharification of the lignocellulosic biomass in different approaches, it became essential to know in detail the enzymes and proteins secreted by this fungus, especially those involved in the hydrolysis of biomass. The aim of this work was to characterize for the first time the protein profiles produced and secreted by C. cubensis after growth in semi- solid media having the wheat bran or sugarcane bagasse as carbon sources and to perform the integration of in silico predictions obtained by computational tools with proteomic data obtained by mass spectrometry. The integration of the computational results with the proteomic data allowed the increase of the identification of the secreted proteins and the prediction of a complete secretion potential of the fungus that can be induced by other carbon sources or cultivation conditions, evidencing its real potential as a microorganism that produces lignocellulolytic enzymes. The present work demonstrated that C. cubensis is able to secrete a greater number and variety of carbohydrate-active enzymes than microorganisms recognized excellent sources of industrial enzymes, as fungi of the genus Aspergillus and Penicillium. It was also observed that C. cubensis presented a secretome composition with exclusive characteristics according to the carbon source to which it was cultivated, revealing the great plasticity in the profile of enzymatic secretion by the fungus. C. cubensis is capable to produce different enzymatic cocktails that can be applied in a variety of lignocellulosic biomasses with distinct characteristics, which cannot be found in commercial products that have a defined composition and a restricted application to the commonly used biomasses. In addition, this fungus was able to secrete families of enzymes that have been extensively studied as targets of great biotechnological interest, such as multi-copper oxidases (MCOs). C. cubensis was able to secrete two MCOs when grown in a mixture of wheat bran and orange peel in the ratio of 3:1. The purified fraction containing two MCOs catalyzed the oxidation of the phenolic compounds produced by the alkaline pretreatment of sugarcane bagasse, which resulted in improved saccharification yields of this material, demonstrating that they are promising enzymes for hydrolysis applications of biomass and of great biotechnological potential. In this way, C. cubensis emerges as a promising alternative for the production of classical lignocellulolytic enzymes and as a source of new enzymatic targets for the bioethanol industry.