Bioquímica Aplicada
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Item Avaliação da relação funcional entre Serine arginine protein kinase 2 (SRPK2) e Thymosin beta 4 (Tβ4) em melanoma metastático murino(Universidade Federal de Viçosa, 2024-05-31) Souza, Juliana Regina Ribeiro de; Brassan, Gustavo Costa; http://lattes.cnpq.br/3985727354332184Melanoma é uma forma de câncer que emerge das células pigmentares da pele, conhecidas como melanócitos. Apresenta alto risco de desenvolver metástase e, com isso, altas taxas de mortalidade. O peptídeo Tβ4, sequestrador de actina endógeno de 4,9 kDa, atua na motilidade celular, transição epitelial-mesenquimal (EMT) e outras múltiplas atividades biológicas, incluindo metástase tumoral. Anteriormente, identificamos uma possível ligação funcional entre Tβ4 e Serine Arginine Protein Kinase 2 (SRPK2), uma proteína relacionada ao controle do splicing do pré-mRNA e que têm sido encontradas superexpressas em diversos tumores, incluindo o melanoma. O objetivo deste estudo foi investigar a relação funcional e a interação entre Tβ4 e SRPK2 no contexto do melanoma metastático. Ensaios fenotípicos in vitro de proliferação celular, migração e formação de colônias foram realizados em células B16F10 de tipo selvagem ou modificadas por CRISPR-Cas9. A dinâmica da actina foi investigada em ensaios de imunofluorescência. Ensaio de ELISA foi realizado para observar a interação. O melanoma metastático foi induzido em camundongos através da injeção de células B16F10. Podemos observar que a expressão de Tβ4 correlaciona-se com mau prognóstico em pacientes com melanoma metastático. Por meio dos ensaios in vitro, observamos que seu efeito na promoção da proliferação celular, migração e formação de colônias foi prejudicado pelo inibidor farmacológico de SRPK ou pela depleção genética de SRPK2. Assim, o Tβ4 promoveu a organização dos lamelipódios da actina, que também foi afetada negativamente pela depleção funcional do SRPK. Além disso, os tratamentos com um inibidor farmacológico de SRPK (SRPIN340) ou com a depleção impediram o crescimento induzido por tumor Tβ4 in vivo. Juntos, esses resultados sugerem que SRPK2 transduz o sinal de Tβ4 em células tumorais para afetar a organização da actina e possivelmente o splicing do pré-mRNA, o que deve ser melhor investigado no contexto do melanoma metastático. Palavras-chave: Melanoma, Tβ4, SRPK2, metástase.Item Coquetéis enzimáticos de fungos para hidrólise de casca de soja e produção de etanol(Universidade Federal de Viçosa, 2024-08-21) Souza, João Batista de; Alfenas, Gabriela Piccolo Maitan; http://lattes.cnpq.br/3052406898092532O etanol de segunda geração (2G) é um combustível alternativo que ajuda a acelerar a transição dos combustíveis fósseis para fontes de energia mais sustentáveis, de baixo impacto e economicamente viáveis. Sua produção consiste em quatro hidrólise enzimática, etapas principais: pré-tratamento, fermentação e destilação. Muitos resíduos agrícolas podem ser processados para serem convertidos em etanol 2G. Mais de 300 milhões de toneladas de soja são produzidas em todo o mundo, gerando milhões de toneladas de casca de soja. Este trabalho teve como objetivo produzir enzimas lignocelulósicas on-site, utilizando bagaço de cana-de- açúcar, casca de soja e farelo de trigo para o cultivo de Aspergillus sydowii, Chrysoporthe cubensis, Hypoxylon sp., Kretzschmaria zonata e Talaromyces pinophilus por fermentação semissólida. Os coquetéis enzimáticos de fungos foram aplicados para hidrolisar casca de soja após os pré-tratamentos hidrotérmico, ácido (H2SO4 0,5 %) e alcalino (NaOH 1,0 %), com foco na liberação de açúcares fermentescíveis para produção de etanol. Após análises de composição química e hidrólise enzimática com o coquetel comercial Cellic® CTec3 HS (Novozymes), o pré-tratamento ácido teve maior impacto na liberação de glicose e xilose, com 13,7 e 7,10 g/L, respectivamente. O perfil enzimático dos 5 fungos cultivados nas diferentes biomassas foi avaliado e destacaram se os extratos de A. sydowii, C. cubensis e T. pinophilus cultivados em casca de soja, bem como de C. cubensis cultivado em farelo de trigo. Quando a etapa de hidrólise enzimática foi realizada em casca de soja pré-tratada com ácido, os extratos de casca de soja C. cubensis e T. pinophilus demonstraram os melhores resultados, convertendo 9,55 e 13,21 % da celulose em glicose. Porém, quando combinados, nas mesmas condições e carga enzimática (2,5 unidades FPase), a taxa de conversão de celulose em glicose aumentou para 36,35 %, mostrando grande potencial como extratos nativos com baixo uso de enzimas. Além disso, ensaios de fermentação foram conduzidos na casca de soja pré-tratada com ácido, hidrolisada pela mistura dos extratos de C. cubensis e T. pinophilus crescidos em casca de soja, e Saccharomyces cerevisiae Innova® Force ADY foi capaz de se adaptar ao meio complexo e gerar 2,03 g/L de etanol, que representa 66,34 % de conversão da glicose em etanol. Palavras-chave: Fungos. Enzimas. Etanol de segunda geração. Casca de soja. Biorrefinarias.Item Defesa da soja contra o ataque de insetos-praga: metilações em flavonóis glicoconjugados derivados da rutina reduzem a sobrevivência da lagarta-da-soja Anticarsia gemmatalis(Universidade Federal de Viçosa, 2024-07-30) Assis, Jéssica Nunes de; Ramos, Humberto Josué de Oliveira; http://lattes.cnpq.br/4630736375439802Item Compostos derivados do timol e carvacrol: avaliação e caracterização da atividade antileishmania in silico e in vitro(Universidade Federal de Viçosa, 2024-08-22) Carvalho, Rayane Luiza de; Vasconcellos, Raphael de Souza; http://lattes.cnpq.br/7707737194646145Leishmanioses são doenças provocadas por protozoários do gênero Leishmania e transmitida por flebotomíneos, é prevalente em países subdesenvolvidos. O relatório mundial mais recente da Organização Mundial da Saúde (OMS), de 2022, registrou entre 700 mil e 1 milhão de novos casos globalmente das diversas formas da doença. Ocorrendo em três formas principais: cutânea, a mais comum, mucocutânea e visceral, sendo esta última potencialmente letal se não tratada. Os atuais tratamentos, como antimoniais pentavalentes, enfrentam desafios de toxicidade e eficácia limitada. Por isso, a pesquisa por novos tratamentos é tão importante. O uso de moléculas derivadas de fontes naturais tem crescido fortemente nos últimos anos. Moléculas como carvacrol e timol se destacam por exibir potencial terapêutico contra diversas doenças. Como câncer e a própria leishmaniose, agindo sobre proteínas cinases, atuando na inibição da atividade dos parasitos, induzindo a morte. A escolha de proteínas cinases como alvos terapêuticos baseia-se na complexidade do ciclo de vida dos parasitos Leishmania e Trypanosoma. Proteínas como AKT-like cinase e caseína cinase (CK) foram identificadas como potenciais alvos leishmanicidas O presente estudo teve por objetivo o teste da atividade leishmanicida de compostos semissintéticos derivados de carvacrol e timol e avaliação da interação dos compostos com atividade antileishmania através de análises de bioinformática estrutural. O estudo testou in vitro da atividade citotóxica em macrófago dos 19 compostos derivados, nomeados de AC, A1 a A11 para os derivados do carvacrol e M1 a M7 para os derivados do timol. Com testes da atividade antileishmania nas espécies L. braziliensis e L. amazonensis, e seleção daqueles que apresentaram atividade para realização de docking molecular da interação proteína ligante, com as proteínas CKI, CRK3, GSK, MAPK, AKT-like (PKA) e SRPK. Além da análise filogenética de sequências de Arabidopsis, Plasmodium, mamíferos e a família de tripanossomatídeos. Dos resultados obtidos, todos os compostos apresentaram CC50 > 200 µM, com maior atividade antileishmania apresentando aproximadamente 60% na triagem nos compostos A6 e A8, definindo valores de IC50 de 11,43 e 11,77 µM, com baixíssima citotoxicidade definida por CC50 acima de 1 mM, nestes dois compostos. Direcionando somente os compostos A6 e A8 para as análises de bioinformática, apresentada pela melhor interação do composto A8 com a maioria das proteínas analisadas. As análises filogenéticas de todas as proteínas mostraram uma distância evolutiva clara entre tripanossomatídeos e mamíferos indicando oportunidade única para o desenvolvimento de fármacos altamente específicos. A compreensão desses mecanismos pode contribuir para o desenvolvimento de tratamentos mais eficazes e com menor toxicidade, abrindo perspectivas promissoras para o combate à leishmaniose. Palavras-chave: Leishmaniose, Citotoxicidade, Carvacrol, Timol, Interação Proteína-liganteItem Potencial inibitório e leishmanicida de derivados do eugenol sobre a cinase Serine Arginine Protein Kinase de Leishmania braziliensis (LbSRPK)(Universidade Federal de Viçosa, 2024-08-23) Souza, Michele Midori Koyama de; Vasconcellos, Raphael de Souza; http://lattes.cnpq.br/8922000480242487Leishmanioses são doenças tropicais negligenciadas que afetam milhares de pessoas no Brasil e no mundo. Causadas por parasitas do gênero Leishmania, manifestam-se principalmente como Leishmaniose Cutânea (LC), Mucocutânea (LMC) e Visceral (LV). No Brasil, LC e LV são endêmicas, causadas predominantemente pela espécie Leishmania braziliensis e Leishmania infantum. Não há vacinas disponíveis, e os tratamentos existentes são caros, inespecíficos e apresentam efeitos colaterais, além de casos de resistência parasitária. Novos alvos farmacológicos estão sendo estudados, e as Serine Arginine Protein Kinases (SRPKs) mostraram-se promissoras, pois estão envolvidas em processos celulares essenciais. Estudos mostraram a presença de SRPK em tripanossomatídeos, e nosso grupo de pesquisa é pioneiro nos estudos envolvendo SRPK em L. braziliensis bem como dos inibidores dessa proteína e seu potencial leishmanicida. O eugenol é um composto natural do grupo dos fenóis que é conhecido por possuir propriedades anti-inflamatórias, analgésicas, antimutagênicas e antialérgicas. Há relatos na literatura de sua eficácia na inibição do crescimento de promastigotas e amastigotas de várias espécies de Leishmania. Sendo assim, este trabalho avaliou o potencial de oito compostos derivados do eugenol, da classe das amidas aromáticas com diferentes substituintes no anel benzênico, como agentes leishmanicidas, seu potencial citotóxico e a capacidade de agir como inibidores de LbSRPK. Para os experimentos de CC50, células de macrófagos (RAW 264.7) e células de promastigotas de L. braziliensis (M2904) foram cultivadas para avaliar a atividade dos compostos. Os compostos não foram tóxicos às células de leishmania na concentração testada e apresentaram valores de CC50 variados em macrófago (295,2 µM; 217,9 µM; ~2775,8 µM; ~241,1 µM; ~267,7 µM; 575,3 µM; 159,0 µM e 759,3 µM respectivamente para compostos numerados de 1 a 8). Para testar o potencial inibitório dos compostos, eles foram projetados na plataforma do Avogadro e avaliados por docking molecular no software GOLD, usando a proteína LbSRPK previamente modelada e validada pelo grupo de pesquisa. As melhores poses foram analisadas no PyMOL e Discovery Studio e ranqueados pelo servidor online Pose & Rank. Todos os compostos demonstraram interação com resíduos presentes no sítio ativo da proteína, sugerindo seu potencial como inibidores, embora mais estudos sejam necessários para confirmar esses achados. Para complementar os estudos, a proteína recombinante LbSRPK foi expressa em sistema bacteriano E. coli BL21(DE3) para posterior teste de atividade e inibição pelos compostos. Esses estudos visam ampliar o conhecimento sobre o papel da LbSRPK em L. braziliensis e explorar esses compostos derivados do eugenol da classe das amidas aromáticas como possíveis inibidores dessa proteína. Palavras-chaves: Leishmanioses, Leishmania braziliensis, LbSRPPK, derivados do eugenol, docking molecularItem Tripeptídeo inibidor de proteases modelado a partir do inibidor natural de soja SKTI altera diferencialmente a expressão gênica e a fisiológica do intestino de Anticarsia gemmatalis(Universidade Federal de Viçosa, 2023-10-19) Santos, Eulálio Gutemberg Dias dos; Ramos, Humberto Josué de Oliveira; http://lattes.cnpq.br/2633964026181142Anticarsia gemmatalis é uma das principais pragas de insetos que causam desfoliação nas lavouras de soja. Estratégias alternativas têm sido avaliadas para reduzir os ataques de insetos, utilizando inibidores de proteases (IP) que atuam como fatores antinutricionais. Os efeitos fisiológicos dos PIs não se limitam apenas aos danos nutricionais causados aos insetos. Eles desencadeiam respostas bioquímicas que podem variar desde a reorientação da síntese de proteinas para produzir novas proteases até o aumento da produção de enzimas envolvidas em vias de defesa. Um tripeptídeo chamado GORE-2 foi projetado a partir do IP SKTI de soja, com maiores capacidades de inibição de proteases, reduzindo a sobrevivência das lagartas. Portanto, os efeitos do IP natural de soja (SKTI) e do peptídeo projetado racionalmente GORE- 2 foram avaliados no nível das mudanças na expressão de genes causadas pelos IPs e sua relação com o estresse oxidativo e as alterações morfológicas das células intestinais. Assim, neste trabalho, avaliamos a reprogramação da expressão gênica por RNA-Seq para verificar as cascatas envolvidas na resposta a esses diferentes IPs. SKTI e.GORE-2 desencadearam uma extensa reprogramação da expressão de genes após 24 horas. A presença de IP na dieta de A. gemmatalis afetou 1474 genes diferencialmente expressos, dos quais 643 e 83] genes responderam a SKTI e GOREZ, respectivamente. Em geral, as respostas foram semelhantes para ambos os PIs, com alterações na expressão dos genes que codificam proteases e proteínas de defesa, principalmente envolvidas na proteção peritrófica da matriz e reconstituição. No entanto, essas respostas foram mais pronunciadas para SKTI, indicando uma cascata de sinalização mais eficiente para acionar os mecanismos de defesa do inseto. Essas diferenças Justificam uma ação mais eficaz do GORE-2 na inibição da proteólise e na redução da sobrevivência das lagartas, indicando que a sinalização pode ser devido à privação de aminoácidos, mas também por um sistema geral de percepção desenvolvido para detectar moléculas repelentes da soja. Visto que o GORE-2 é um tripeptídeo mimético do inibidor de proteases SKTI, a cascata de sinalização parece ser menos eficiente. Na verdade, a expressão gênica para processos de desintoxicação e estresse oxidativo foi maior para o GORE-2. Portanto, é uma vantagem adicional do uso de inibidores de proteases miméticos ou sintéticos. Nesse sentido, o tripeptideo GORE? se apresenta como uma alternativa eficiente no controle de A. gemmatalis. Palavras-chave: Anticarsia gemmatalis. Transcriptoma. Glycine max. Manejo de pragas agrícolas.Item Study and expression of a thermostable laccase from Chrysoporthe cubensis in Komagataella phaffii and application in dye decolorization(Universidade Federal de Viçosa, 2024-08-23) Gomes, Riziane Ferreira; Guimarães, Valéria Monteze; http://lattes.cnpq.br/8011775910184899Item Lipoproteína de Staphylococcus aureus: expressão e participação na invasão de células MAC-T em condições encontradas na glândula mamária bovina(Universidade Federal de Viçosa, 2024-08-27) Canizo, Yasmim do Nascimento; Ribon, Andréa de Oliveira Barros; http://lattes.cnpq.br/5065715346710729Lipoproteínas são proteínas de membrana encontradas em S. aureus que exercem diversas funções celulares e estão relacionadas à patogenicidade bacteriana. Um grupo especial de lipoproteínas, denominadas lipoproteínas-like (lpls) vem sendo associado à invasão em células humanas. Essas proteínas são codificadas por genes que estão organizados em um cluster localizado em uma ilha de patogenicidade. Um estudo realizado por nosso grupo identificou no genoma de S. aureus 302, cepa isolada de mastite bovina subclínica, um cluster contendo 6 lpls que têm uma identidade superior a 80%, porém baixa homologia com as lpls de S. aureus RF122, cepa associada à mastite clínica severa. Para avaliar o papel da Lpl na invasão de células imortalizadas do epitélio mamário bovino (MAC-T), uma Lpl de SAU302 foi expressa em Escherichia coli C41 e purificada por cromatografia de afinidade. O sequenciamento do clone comprovou a clonagem do gene de interesse. A proteína recombinante de 31 kDa foi expressa nas frações solúvel e insolúvel. Para os ensaios de invasão, células MAC-T foram incubadas por uma hora com concentrações de 35 a 4.375 µg/mL de lipoproteína recombinante antes da adição da bactéria. Observou-se que apenas as concentrações de 35 e 17,5 µg/mL aumentaram significativamente a invasão em 87% e 53%, respectivamente. Células MAC-T foram incubadas com S. aureus 302 por 30 minutos, 1:30 h e 3 h em meio DMEM contendo 0,6 mM de bipiridina (quelante de ferro), 0,6 mM de bipiridina e concentrações subinibitórias (0,5xCIM) de ampicilina, ciprofloxacina e gentamicina. No tempo de 30 minutos, houve diminuição de até 62% na invasão em todas as condições, quando comparadas ao controle. No tempo de 1 hora e 30 minutos, apenas o acréscimo de bipiridina causou diminuição significativa na invasão. No tempo de 3 horas, a combinação de bipiridina e ciprofloxacina e bipiridina e gentamicina diminuiu a invasão em 77,61% e 81,96%, respectivamente. Para analisar a expressão dos genes lpls, a cepa S. aureus 302 foi cultivada em diferentes condições de estresse, em meio BHI. A extração do RNA total foi feita da cultura na fase de crescimento estacionária, seguida de síntese do cDNA com random primers e RT-qPCR com primer complementar a todos os genes lpls. Observou-se que o acréscimo de bipiridina 0,6 mM, de concentrações subinibitórias de ciprofloxacina e o cultivo da bactéria a 39 ºC com ou sem presença de bipiridina 0,6 mM diminuiu significativamente a expressão dos genes lpls. O acréscimo de bipiridina 0,6 mM e concentrações subinibitórias de ampicilina, ciprofloxacina e gentamicina juntos diminuiu drasticamente a expressão. Os resultados confirmam a expressão de uma Lpl de S. aureus e sugerem que ela promove a invasão bacteriana. Este trabalho foi o primeiro a avaliar a expressão de genes que codificam lpls em condições que simulam o ambiente encontrado pela bactéria e sugere que a lipoproteína auxilia na invasão de células mamárias do epitélio bovino. Palavras-chave: Lipoproteína; Invasão celular; Expressão gênica.Item Relação funcional entre Serine Arginine Protein Kinase 2 (SRPK2) e Thymosin Beta 4 (Tβ4) em melanoma metastático murino(Universidade Federal de Viçosa, 2020-02-20) Souza, Juliana Regina Ribeiro de; Brassan, Gustavo Costa; http://lattes.cnpq.br/3985727354332184Item Inibição farmacológica das Serine Arginine Protein Kinases (SRPKs): potencial papel na metástase e na atividade imunológica no microambiente do melanoma murino(Universidade Federal de Viçosa, 2020-02-19) Moreira, Gabriela Alves; Bressan, Gustavo Costa; http://lattes.cnpq.br/9128531718627282