Ciências Biológicas e da Saúde
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Item Virulência e resistência de Salmonella enterica exposta ao peptídeo antimicrobiano nisina(Universidade Federal de Viçosa, 2019-06-13) Silva, Fernanda Pereira da; Vanetti, Maria Cristina Dantas; http://lattes.cnpq.br/7651923743467176Salmonella enterica é um importante patógeno de origem alimentar de impacto global, que causa gastroenterite e febres entéricas. Alternativas para o controle do crescimento microbiano utilizando peptídeos antimicrobianos têm sido demonstradas ao longo dos anos e a nisina se destaca como uma substância considerada segura (GRAS). Nisina é um peptídeo catiônico que se liga ao lipídio II da membrana interna dos procariontes e tem sido intensamente utilizado no controle de bactérias Gram-positivas. O objetivo deste trabalho foi avaliar a ação da nisina no crescimento, formação de biofilme, expressão gênica, virulência e resistência de Salmonella Enteritidis PT4 578. O efeito inibidor da concentração sub-inibitória (sub-MIC) de nisina de 11,72 μM foi potencializado na presença de pH baixo (4,0; 4,5 e 5,5) e de NaCl (1,5, 2,5 e 5,0%), mas não na presença de 500 e 1000 µM de H 2 O 2 . Quando S. enterica foi exposta a concentrações sub-MIC de nisina de 11,72 μM e 46,88 μM, o perfil de alguns genes transcritos aumentou a expressão, como os genes de resistência (pagC), virulência (invA e invF) e formação de biofilme (fimF). O aumento da virulência de S. enterica promovido por concentrações sub-MIC de nisina foi confirmado em larvas de Galleria mellonella, que apresentaram maior taxa de mortalidade em menor tempo pós-inoculação e interferência na resposta imune celular e humoral, com redução do número de hemócitos totais, formação de nodulação e pseudópodes (protrusões), biossíntese de melanina (melanização) e regulação de proteínas de defesa (cactus e peroxidases). Estes resultados demonstram que agentes estressores potencializam o efeito da nisina no controle do crescimento de S. enterica e que nisina aumenta a virulência desse patógeno em um modelo animal.Item Systematic of foliicolous and phytopathogenic fungi associated with native plants of the Brazilian Cerrado stricto sensu(Universidade Federal de Viçosa, 2019-02-19) Abreu, Vanessa Pereira de; Pereira, Olinto Liparini; http://lattes.cnpq.br/1348590876266814Cerrado is a home of huge diversity of endemic species of plants and animals. Therefore, it is considered a global biodiversity hotspot, however it is the Brazilian biome that has lost most native vegetation cover in recent years. Recent studies emphasize that the Cerrado may suffer the greatest extinction of plant species and consequently, the fungi suffer the same effects, because they are associated with vegetation and soil. They may also be threatened, and few studies have been carried out to discover the fungal diversity associated with Cerrado plant species. Knowledge of Cerrado micodiversity began with the activities of European collectors in the late 19th century and descriptions of new species and genera were based only on fungi morphology. Even the most recent descriptions were based only on morphological data without molecular information, which would allow the comparison and phylogenetic analyzes with other species in the world. The objective of this work was to determine and describe the foliicolous and phytopathogenic mycobiota associated with Cerrado native plants, based on morphological and molecular analyzes, as well as to establish the phylogenetic positioning of the species found and to initiate a fungal culture collection of this biome. A total of 82 plant materials were collected and 92 fungi belonging to several genera were isolated, when possible, and of these, six genera were selected for the taxonomy and molecular phylogeny studies. This study reports 3 possible new genera (Paraopeba, Dictyosporina and Trochilispora); 5 possible new species (Mastigosporella pigmentata, Pseudocercospora styracina, Trochilispora schefflerae, Dictyosporina ferruginea and Paraopeba schefflerae) and a possible epitypification (Uleomyces sanguineus) will be proposed. These results corroborate the great diversity of fungal species found by other researchers in the Cerrado biome and represent a contribution to the knowledge of the diversity of follicolous and phytopathogenic fungi associated with different native plants of the Floresta Nacional de Paraopeba (FLONA - Paraopeba).Item Influência do fago vB_EcoM-UFV13 no biofilme formado pelo consórcio P48SEP(Universidade Federal de Viçosa, 2019-07-04) Carmo, Adriele Jéssica do; Paula, Sérgio Oliveira de; http://lattes.cnpq.br/3568973204091382O controle da corrosão microbiologicamente induzida (MIC) é um desafio crescente no setor de exploração de petróleo e gás. A MIC é o resultado de uma série de reações eletroquímicas, influenciadas ou dirigidas por microrganismos, como as bactérias redutoras de sulfato (BRS), que se acumulam na superfície das tubulações formando os biofilmes, ocasionando grandes prejuízos econômicos. As BRS são microrganismos anaeróbios que utilizam sulfato como aceptor final de elétrons, levando a produção de sulfeto de hidrogênio, um produto altamente reativo, corrosivo e tóxico. A principal forma de controle das BRS atualmente, é a injeção de biocidas, no entanto, esses produtos químicos não conseguem penetrar na matriz do biofilme e alcançar os microrganismos presentes, além do mais, são caros, requerem a aplicação contínua, e podem levar à geração de bactérias resistentes, representam um risco para os seres humanos e o meio ambiente devido à sua toxicidade e a persistência nos resíduos industriais. Dessa forma, há a necessidade de desenvolver abordagens mais eficientes e específicas no controle do processo de biocorrosão no setor petrolífero. Neste trabalho, foi avaliado o potencial do fago vB_EcoM-UFV13 em três diferentes concentrações (baixa: 10 4 UFP/mL, média: 10 8 UFP/mL e alta: 10 12 UFP/mL) na prevenção da formação de biofilme em cupons de aço carbono pelo consórcio bacteriano P48SEP constituído por BRS isolado de água de produção obtida da exploração de petróleo. Através da microscopia eletrônica de varredura, análise da composição química do biofilme e contagem celular por meio de citometria de fluxo demostraram a capacidade do fago em média (10 8 UFP/mL) e alta (10 12 UFP/mL) concentração de prevenir a formação de biofilme desenvolvido pelo consórcio, diminuir as principais biomoléculas responsáveis pelo processo de adesão e estabilização do biofilme, e também reduzir o número de células vivas aderidas ao cupom. Além disso, a presença do vírus foi capaz de alterar o padrão de expressão gênica de genes relacionados à formação do biofilme e genes envolvidos na captura, transporte e armazenamento do ferro nas células, assim como, os níveis de abundância relativa de proteínas relacionadas à formação do biofilme e resposta celular ao estresse. Este estudo mostra pela primeira vez a capacidade de um bacteriófago de prevenir a formação de biofilme proveniente de BRS, sendo uma alternativa promissora para o controle da biocorrosão em oleodutos e tanques de armazenamentos de petróleo. Palavras-chaves: Fago. Bactérias redutoras de sulfato. Biocorrosão.Item Plant soil feedback e inoculação de fungos micorrízicos em mudas de vinhático e braúna(Universidade Federal de Viçosa, 2018-02-22) Prates Júnior, Paulo; Kasuya, Maria Catarina Megumi; http://lattes.cnpq.br/6908923186618591A produção de mudas de espécies nativas, a exemplo de vinhático e braúna, é altamente relevante para recompor áreas florestais e favorecer a conectividade funcional e o fluxo gênico entre espécies. Entretanto, essas duas espécies apresentam sobrevivência menor que 2 % quando cultivadas em substrato comercial em condições de viveiro, o que pode estar relacionada à ausência de microrganismo simbiontes nos substratos de cultivo. Essa questão abre espaço para a interseção de diferentes campos de conhecimento, dentre os quais a ecologia, botânica, engenharia florestal, ciências do solo e microbiologia que, avaliados de modo integrado, podem auxiliar na compreensão do problema de pesquisa. Esta tese teve como objetivo avaliar a teoria do plant-soil feedback por meio da sobrevivência e o crescimento de mudas de vinhático e braúna, inoculadas com microrganismo simbiontes provenientes de uma planta adulta da mesma espécie. Para tanto, as mudas foram crescidas em diferentes proporções de substrato:solo, bem como da fertilização com P, avaliando-se o crescimento vegetal e a comunidade microbiana, para entender a dinâmica da simbiose entre plantas e a comunidade microbiana. Deste modo, este estudo mostrou que tanto o vinhático como a braúna apresentam plant-soil feedback positivo e estabelecem associação com Bradyrhizobium sp. Entretanto, diferentemente de vinhático, braúna parece não ser uma espécie caracteristicamente micorrízica. Os estudos demonstraram também que as características físico-químicas dos substratos influenciam a comunidade microbiana, o pH e a disponibilidade de nutrientes e, consequentemente, o crescimento dessas espécies. Este estudo abriu a possibilidades de explorar aspectos da simbiose micorrízica e com rizóbios por meio do plant-soil feedback, fertilização e alterações nos substratos de cultivo, demonstrando a importância de se associar a composição do substrato com os microrganismo benéficos para garantir a sobrevivência e o crescimentos das espécies nativas.Item Indução e recuperação do estado viável não cultivável de Salmonella enterica e Shigella flexneri(Universidade Federal de Viçosa, 2017-02-24) Oliveira, Mayara Messias; Vanetti, Maria Cristina Dantas; http://lattes.cnpq.br/8454682468269484O estado viável não cultivável (VNC) foi verificado em diversas espécies de micro- organismos, muitas das quais são patógenos de importância alimentar, tais como Salmonella e Shigella. Nesta condição, os micro-organismos perdem a capacidade de crescer nos meios de cultura convencionais, mas mantém viabilidade quando analisados por técnicas de contagem direta, como microscopia. Salmonella e Shigella podem entrar nesta condição fisiológica como mecanismo de resposta as variações ambientais e recuperar culturabilidade quando as condições de sobrevivência forem novamente favoráveis. Neste trabalho, foi acompanhado o comportamento de Salmonella enterica sorovar Enteritidis PT4 578 e Shigella flexneri durante a indução ao estado VNC, além de avaliar estratégias de reativação celular. Após a entrada no estado VNC por estresse nutricional, associado ao osmótico e baixa temperatura ou ao estresse oxidativo, as células foram submetidas a diversos tratamentos de recuperação, utilizando a combinação de alguns fatores, tais como meios de cultura, temperatura de incubação, agentes antioxidantes, condição atmosférica e métodos de esterilização dos meios. S. flexneri mostrou-se mais resistente às condições de estresses as quais foram expostas para indução ao estado VNC, pois células cultiváveis foram detectadas em meio de cultura após 277 dias sob os estresses nutricional, osmótico e frio, ao passo que Salmonella Enteritidis perdeu a culturabilidade em caldo BHI, após 133 dias de indução por estes mesmos agentes estressantes. Sob condições de estresse oxidativo, este sorovar não apresentou crescimento em TSA após 3 horas de indução, enquanto S. flexneri foi capaz de crescer após este mesmo período de tratamento. Análises por citometria de fluxo revelaram a presença de células viáveis de ambas espécies sob as condições de estresses utilizadas para indução ao estado VNC, entretanto, não foi possível recuperar a culturabilidade destas células utilizando as condições propostas, nas quais diversos fatores foram combinados totalizando assim 69 tratamentos de recuperação. Além disso, não foi observada diferença da presença de espécies reativas de oxigênio (ROS) intracelular entre células em estado VNC e células viáveis em fase estacionária de crescimento em ambas espécies estudadas.Item Diversidade de fungos associados ao sistema radicular de Gomesa recurva em diferentes forófitos(Universidade Federal de Viçosa, 2017-02-24) Freitas, Emiliane Fernanda Silva; Kasuya, Maria Catarina Megumi; http://lattes.cnpq.br/3658808622420778Além de ser a mais diversa entre todas as Angiospermas e ser amplamente distribuída entre todos os continentes, a família Orchidaceae destaca-se por ser aquela que apresenta maior número de espécies epífitas. As orquídeas apresentam como característica comum sementes sem endosperma, necessitando da associação com fungos micorrízicos para suprir a necessidade de carbono e outros nutrientes e, assim, viabilizar a germinação. Dessa forma, a compreensão dos fatores que definem os parceiros simbióticos das orquídeas é fundamental para garantir a conservação da família. O objetivo do presente trabalho foi verificar influência do forófito no perfil da comunidade fúngica associada ao sistema radicular de Gomesa recurva, uma orquídea epífita. Os resultados mostraram baixa similaridade entre a comunidade fúngica das orquídeas em uma mesma espécie de forófito, indicando que o forófito não tem influência direta na comunidade de fungos de G. recurva. Este resultado foi confirmado por sequenciamento, que também revelou que esta orquídea se associa principalmente com o gênero Ceratobasidium. Este é o primeiro estudo que investiga, a partir de técnicas independentes de cultivo, a relação de fungos em orquídeas epífitas e o forófito ao qual estas plantas estão associadas.Item Diversidade de micro-organismos endofíticos em eucalipto(Universidade Federal de Viçosa, 2015-05-29) Miguel, Paulo Sérgio Balbino; Costa, Maurício Dutra; http://lattes.cnpq.br/8644923911722035Árvores pertencentes ao gênero Eucalyptus estão entre as mais cultivadas em todo o mundo. O rápido crescimento do eucalipto e a sua adaptabilidade a vários ambientes podem ser compreendidos pelo estudo da comunidade microbiana presente nessa planta. Essa comunidade é composta por micro-organismos endofíticos e epifíticos. Endofíticos colonizam os tecidos internos de plantas saudáveis sem causar sintomas ou efeitos negativos à planta. Neste estudo, foram avaliadas a diversidade e a distribuição de fungos endofíticos em folhas e exsudatos xilemáticos de plantas de eucalipto com 18 e 72 meses de idade. As coletas foram realizadas no início do período chuvoso e durante os períodos chuvoso e seco. Avaliou-se, também, a diversidade de bactérias, fungos e leveduras em plantas provenientes de diferentes fases de desenvolvimento: jardim clonal, sombreamento, recém-saídas do sombreamento, expedição e campo. A diversidade microbiana foi relacionada à concentração de açúcares. Após extração de DNA de folhas e exsudatos xilemáticos, os amplicons obtidos por amplificação das subunidades do rRNA 16S, 18S e 26S foram utilizados na DGGE e as bandas eluídas dos géis foram sequenciadas. A avaliação da composição da comunidade bacteriana em folhas do jardim clonal, sombreamento, recém-saídas do sombreamento, expedição e campo também foi comprovada pelo isolamento e sequenciamento do rRNA 16S das colônias. A comunidade de fungos endofíticos foi afetada pela idade das plantas e pela sazonalidade. A análise filogenética mostrou a dominância de fungos dos filos Ascomycota e Basidiomycota. Neste estudo, foi apresentado o relato inédito de Marasmius alliaceus, Ganoderma boninense, Alloclavaria purpurea, Coniophora puteana, Boletus rubropunctus, Dichomitus squalens, Fusarium solani, Wallemia sebi e Teratosphaeriaecea sp. como habitantes dos exsudatos xilemáticos em plantas. No viveiro, a colonização endofítica da parte aérea de eucalipto foi dependente das fases de desenvolvimento da planta. Neste estudo, foi relatada pela primeira vez a presença das leveduras dos gêneros Pichia sp., Candida, Nilaparvata, Saturnispora sp., Malassezia, Bensingtonia e das espécies Rhodosporidium fluviale e Aureobasidium pullulans como endofíticas em eucalipto. Bactérias dos filos Firmicutes, Proteobacteria, classes Alfa, Beta e Gamma, e Actinobacteria foram identificadas na comunidade investigada. Nessa comunidade, as espécies Novosphingobium barchamii, Rhizobium grahami, Stenotrophomonas panacihumi, Paenibacillus terrigena, Paenibacillus darwinianus e Terrabacter lappili foram identificadas pela primeira vez como endofíticas. Proteobacteria foi o filo mais representativo em folhas de mudas nas fases de sombreamento e recém-saídas do sombreamento; e Firmicutes, em plantas a campo. Observaram-se correlações negativas entre os teores de glicose, frutose e sacarose e os índices de diversidade e riqueza microbianas. A distribuição das espécies de fungos, leveduras e bactérias endofíticas em eucalipto mostrou ser distinta e específica para as fases de desenvolvimento da planta. Algumas espécies bacterianas encontradas apresentam potencial para fixação de nitrogênio.Item Análise in silico e caracterização funcional de RNAs pequenos reguladores: alvos e fenótipos envolvidos em Actinobacillus pleuropneumoniae(Universidade Federal de Viçosa, 2018-09-06) Sanches, Newton Moreno; Bazzolli, Denise Mara Soares; http://lattes.cnpq.br/8446507970942803Actinobacillus pleuropneumoniae (App) é o agente causal da pleuropneumonia suína, doença que causa uma pleuropneumonia fibrinosa, exsudativa, hemorrágica, necrosante, que afeta porcos de todas as idades, levando à morte súbita e grandes perdas econômicas em todo o mundo. Existem dois métodos básicos para limitar a infecção endêmica de App: antibióticos e vacinas, mas a segunda opção não é eficiente para controlar a pleuropneumonia porcina. A virulência de App é complexa e envolve diferentes fatores bacterianos que incluem exotoxinas, polissacarídeos capsulares e lipopolissacarídeos. Além disso, existem fatores adicionais de virulência que são up- ou down-regulados durante a infecção e pequenos RNAs reguladores (sRNAs) podem regulá-los. Recentemente, nosso grupo identificou 23 sRNAs em App, cuja transcrição foi validada por RNA-Seq. Neste trabalho selecionamos seis genes sRNA e produzimos mutantes de deleção a partir dos parentais selvagem (WT_ΔsRNA) e de seu mutante isogênico para a chaperona de sRNAs, Hfq (Δhfq_ΔsRNA). Além disso, propomos uma análise robusta in silico da estrutura, conservação e interação dos RNAs de App com seus alvos. Os fenótipos desses mutantes foram comparados aos da linhagem parental sob diferentes condições, como: curva de crescimento, crescimento sob diferentes condições de estresse, determinação da concentração inibitória mínima contra antibióticos, adesão em superfícies bióticas e abióticas, atividade hemolítica e virulência no modelo alternativo de infecção, Galleria mellonella. As linhagens ΔsRNA exibiram uma diferença fenotípica em relação às linhagens parentais sob pelo menos uma condição, revelando que os sRNAs de App estão envolvidos na regulação da virulência. Notavelmente, alguns mutantes de deleção simples mostraram um fenótipo de ganho de função, que ainda não foi descrito para nenhum outro mutante de deleção de gene de sRNA na família Pasteurellaceae. Além disso, um mutante mostrou uma forte atenuação de virulência, sendo um candidato para elaboração de uma vacina viva atenuada contra A. pleuropneumoniae. As análises in silico revelaram a presença de sRNAs de App em seis gêneros da família Pasteurellaceae. Vários alvos foram encontrados e categorizados em diferentes funções, evidenciando uma complexa rede de regulação gênica para esses RNAs. A partir desses resultados, propomos um modelo de ação via Arrc14 em que ele atua como regulador negativo no metabolismo de amino e nucleotídeo açúcares. Nossos resultados permitem concluir que os sRNAs aqui estudados interferem de forma distinta na regulação da virulência de Actinobacillus pleuropneumoniae sorotipo 8. Concluímos ainda que, com base nos dados obtidos para RNA01, a linhagem WT_Δrna01 possui potencial para ser utilizada no desenvolvimento de uma vacina atenuada viva para prevenir e controlar infecções por Actinobacillus pleuropneumoniae.Item Assessment of ethanol tolerance of Kluyveromyces marxianus CCT 7735 selected by adaptive laboratory evolution(Universidade Federal de Viçosa, 2018-08-29) Silveira, Fernando Augusto da; Silveira, Wendel Batista da; http://lattes.cnpq.br/4876491797184708Whey is a by-product formed during the cheese-making, which presents lactose (4.5-5% w/v), soluble proteins, lipids, mineral salts and other components. It is the most abundant liquid waste generated in the dairy industries, which can lead to the pollution of water bodies due to its high biochemical oxygen demand and chemical oxygen demand. Whey permeate (WP) is a by-product constituted by lactose, produced from whey ultrafiltration. This way, WP can be converted by lactose-assimilating microorganisms, like yeasts, into value-added products. Kluyveromyces marxianus CCT 7735 has been showing a great potential for producing ethanol from lactose. However, its low ethanol tolerance is a drawback to be overcome, i. e., its growth is highly inhibited from 4% of ethanol (v/v). Adaptive laboratory evolution was used to select ethanol-tolerant K. marxianus CCT 7735 strains (ETSs). ETSs were grown under ethanol stress (4%, v/v) for long periods of time, over many generations (310-340 number of generations), in order to select the ethanol-tolerant phenotypes. From the determination of the physiological parameters, ETSs did not present alterations in their fermentative capacity, when compared their parental strains. However, ETS4 strain stood out for displaying a specific growth rate higher than the parental strain under ethanol stress (above 100%) and a specific ethanol production rate superior to all strains evaluated in this work. The metabolomic and fatty acids analysis were carried out with both ETS4 and parental strains to gain insights into the mechanisms related to the acquisition of ethanol tolerance. The accumulation of some amino acids (glutamate, alanine, valine, proline, and leucine) and metabolites of the citric acid cycle (isocitric acid, citric acid, cis-aconitic acid and malic acid) in ETS4 was found to be associated with the acquisition of ethanol tolerance. Furthermore, high fatty acids content and ergosterol in ETS4 compared to the parental strain indicate differences in their plasma membrane composition, which is consistent with metabolite leakage observed in the parental strain. Therefore, the accumulation of amino acids and citric acid cycle metabolites, as well as the alteration in the fatty acid and ergosterol contents contributed to the acquisition of ethanol tolerance in K. marxianus.Item Reviewing the functions of ethylene in growth and central metabolism in tomato(Universidade Federal de Viçosa, 2017-03-13) Nascimento, Vitor de Laia; http://lattes.cnpq.br/9069530912654269It is responsible for regulating various aspects of the plant life cycle, including seed germination, root initiation, root development, floral development, sexual determination, fruit ripening, senescence and responses to biotic and abiotic stresses. The biosynthetic pathway and the series of reactions to formation of ethylene are already well established. In addition, the ethylene signaling process is also well characterized in that receptors on the membranes recognize this gas and a signaling cascade is activated to the nucleus where ethylene responsive genes are expressed. Much is known about how phytohormones in general influence plant development or how it relates to the signaling and transduction of information that help these organisms to adapt to the most diverse conditions. On the other hand, little is known about its direct relationship with carbon metabolism. The main goal of this work was to provide an enhanced comprehension coupled with a revalidation of the functional role of ethylene as a growth-related phytohormone. Remarkably, the results described within this thesis further demonstrate that ethylene, plant growth and carbon metabolism are strictly associated. Interestingly, ethylene seems to act directly on plant growth by inhibit or, in absence of your perception, allow the increased growth in tomato plants. Thus, it was demonstrated that an exogenous application of this hormone is able to reduce plant growth coupled with several morphological and metabolic adjustments. By contrast, in tomato Never ripe mutant plants, that are ethylene insensitive, growth is fairly induced coupled with significant changes in carbon assimilation characterized by increases in photosynthesis and an extensive metabolic reprogramming. Finally, after revisiting the possible functions of ethylene as a plant growth regulator, we can conclude that a biphasic effect of ethylene occurs in tomato once opposite effects are exhibited on plant growth. It is reasonable to suggest that metabolic and biochemical mechanisms that govern these two phenomena are not necessarily opposites.