Unveiling plant cell signaling: Cell death responses and AtRGS1 phospho-barcode

Abstract

Plant adaptation/acclimatation relies on the perfect adjustment of the organism and the environment interaction, requiring a complex and robust cooperation among different players. Any alteration in this interaction can disrupt the cell homeostasis, activating various responses. From signal perception to gene expression regulation and subsequently cell fate control, intricate signaling cascades play essential roles in these processes, facilitating communication among diverse organelles. In the present work, we aimed to describe and seek elucidating factors that are involved in specific cell signaling, as well as their function in the perception, propagation, and the response to an environmental signal. Firstly, in the first chapter titled “Cell death signaling from endoplasmic reticulum stress: plant-specific and conserved features'', we reviewed the main aspects of the endoplasmic reticulum (ER) stress signaling and its evolutionary conservation in plant organisms, focusing on the different cell death signaling activated by ER stress responses. The ER is an important organelle responsible for controlling the correct folding and post-translational modification of secretory proteins, Ca2+ homeostasis and protein quality control. Under normal conditions the ER protein dynamic is stabilized by the rate of synthesis/folding and organelle loading system. However, when the correct balance is disrupted, it starts accumulating unfolded proteins and, thus, triggers signaling pathways to restore the normal condition, such as the unfolded protein response (UPR). The unfolded protein accumulation can be triggered by many different conditions, such as biotic and abiotic stresses. To restore the perfect balance in the ER four main processes are stimulated: decreasing the protein synthesis rate; an increase in the ER chaperone expression; positive modulation of ERAD genes; expansion of ER internal capacity. Those mechanisms can be modulated by two main branches that are associated with ER-membrane- bound proteins: IRE1 and bZIP transfactors. The molecular chaperone BiP, also plays an important role in the signaling modulation, acting as chaperone and sensor of the stress. Thus, the combination of different factors and responses allow the cell to cope with ER stress in order to maintain the cell function and survival. However, prolonged stress conditions that cannot be restored may trigger autophagy or programmed cell death (PCD) responses originating from the ER, enabling organism survival at the expense of specific cells. Plant PCD shares conserved and unique signaling pathways capable of modulating, activating, and executing the cell death process. A unique plant response involves NAC (NAN/ATAF/CUC) transcription factor family modules, which can include: the DCD/NRP-mediated cell death component; bZIP28/bZIP60- ANAC089-mediated cell death component; ANAC013/ANAC017 component. Collectively, these diverse mechanisms are important in cell homeostasis, by perceiving, propagating, and activating specific responses in order to maintain the organism's survival. Likewise, another conserved signaling pathway was studied in Chapter 2 titled “Revealing the impact of AtRGS1 residues phosphorylation in the plant cell signaling”. In this chapter we seek to understand the effect of post-translational modifications on RGS1, and their role on the structure and function of AtRGS1. Heterotrimeric G-proteins, vital for growth, development, stress responses, and pathogen defense, are negatively regulated by the seven-transmembrane Regulator of G-protein signaling (7TM-RGS) instead of GPCRs found in animals. Arabidopsis AtRGS1, with its C-terminus serine phosphorylation cluster, detaches from the G- protein alpha subunit (AtGPA1) upon phosphorylation, activating beta-arrestin-like endocytosis and G-signaling cascades. Beyond the cluster, AtRGS1 has serine residues at the RGSbox terminus (Ser417) and linker region (Ser278), often overlooked due to the focus on truncated forms. Our molecular dynamics simulations (MDS) on a plant plasma membrane model show that phosphorylation in the linker region controls RGS domain positioning via hydrogen bonds with RGSbox residues. This mechanism, consistent in the phospho-mutant S278E, is also seen in lycophytes, suggesting a conserved regulatory pattern. In vivo Split Firefly Luciferase (SFluc) assays revealed that the S278E variant, mimicking phosphorylated S278, exhibits reduced interaction with AtGPA1 compared to wild type. Additional MDS and SFluc analysis with several phosphomimetic mutants of both proteins indicated that concurrent phosphorylation of S278 in AtRGS1 and Y166 in AtGPA1 is necessary for stable interaction, pointing to a complex interplay of phosphorylation events in plant G protein regulation. Our findings also demonstrate that phosphorylation of S278 is a pivotal modulator in the internalization, stability and nuclei translocation processes. Finally, S278 residue has an important role in the anti-bacterial immune system response. Collectively, these results suggest that the phosphorylation pattern of AtRGS1, especially S278 and cluster, acts as a barcode directing responses to various elicitors, influencing membrane domain positioning and overall signaling processes. Keywords: UPR; ER-stress; Programmed cell-death; RGS1; G-signaling; Phosphorylation; Structure; Internalization.A adaptação/aclimatização de plantas depende do ajuste perfeito da interação entre o organismo e o ambiente, necessitando de uma cooperação complexa e robusta entre diferentes componentes. Alterações nessa interação podem perturbar a homeostase celular, ativando uma variedade de respostas. Desde a percepção de sinais até a regulação da expressão gênica e, posteriormente, o controle do destino celular, sofisticadas cascatas de sinalização desempenham papéis essenciais nesses processos, facilitando a comunicação entre diversas organelas. No presente trabalho, buscamos descrever e elucidar fatores envolvidos em sinalização celular específica, bem como sua função na percepção, propagação e resposta a um sinal ambiental. No primeiro capítulo, intitulado "Sinalização de morte celular a partir do estresse do retículo endoplasmático: características específicas de plantas e conservação evolutiva", revisamos os principais aspectos da sinalização do estresse do retículo endoplasmático (ER) e sua conservação evolutiva em diferentes organismos, concentrando-nos nas sinalizações de morte celular ativadas por respostas ao estresse do ER. O ER é uma organela importante responsável pelo controle do correto enovelamento e modificação pós-traducional de proteínas secretórias, homeostase de Ca2+ e controle de qualidade de proteínas. Sob condições normais, a dinâmica proteica do ER é estabilizada pela taxa de síntese/enovelamento e pelo sistema de armazenamento da organela. No entanto, quando o equilíbrio correto é perturbado, começam a se acumular proteínas mal dobradas e, assim, desencadeiam vias de sinalização para restaurar a condição normal, como via de resposta a proteínas mal dobradas (UPR). A acumulação de proteínas mal dobradas pode ser desencadeada por diferentes condições, como estresses bióticos e abióticos. Para restaurar o equilíbrio perfeito no ER, quatro processos principais são estimulados: diminuição da taxa de síntese de proteínas; aumento da expressão gênica de chaperonas do ER; modulação positiva de genes ERAD; expansão da capacidade interna do ER. Esses mecanismos podem ser modulados por dois ramos principais associados a proteínas ancoradas na membrana do ER: IRE1 e transfatores bZIP. A chaperona molecular BiP também desempenha um papel importante na modulação da sinalização, atuando como chaperona e sensor do estresse. Assim, a combinação de diferentes fatores e respostas permite que a célula lide com o estresse do ER para manter a função e a sobrevivência celular. No entanto, condições de estresse prolongado que não podem ser sanadas, podem desencadear respostas de autofagia ou morte celular programada (PCD) originadas no ER, permitindo a sobrevivência do organismo às custas de células específicas. A PCD de plantas compartilha vias de sinalização conservadas e únicas capazes de modular, ativar e executar o processo de morte celular. Uma resposta única de plantas envolve os módulos da família de fatores de transcrição NAC (NAN/ATAF/CUC), que podem incluir: o módulo de morte celular mediado por DCD/NRP; o módulo de morte celular mediado por bZIP28/bZIP60- ANAC089; o módulo ANAC013/ANAC017. Coletivamente, esses mecanismos diversos são importantes na homeostase celular, percebendo, propagando e ativando respostas específicas para manter a sobrevivência do organismo. Da mesma forma, outra via de sinalização conservada foi estudada no Capítulo 2, intitulado "Revelando o impacto da fosforilação de resíduos em AtRGS1 na sinalização celular de plantas". Neste capítulo, buscamos entender o efeito de modificações pós-traducionais em RGS1 e seu papel na estrutura e função de AtRGS1. Proteínas G heterotriméricas, vitais para crescimento, desenvolvimento, respostas ao estresse e defesa contra patógenos, são negativamente reguladas pelo regulador de sinalização sete transmembranas de proteínas G (7TM-RGS), em vez de GPCRs encontrados em animais. AtRGS1 de Arabidopsis, com sua região de cluster de fosforilação de serina no C-terminal, se separa da subunidade alfa da proteína G (AtGPA1) após a fosforilação, ativando a endocitose, semelhante a beta-arrestina e as cascatas de sinalização G. Além da região de cluster, AtRGS1 possui resíduos de serina no domínio denominado RGSbox (Ser417) e na região de linker (Ser278), muitas vezes negligenciados devido ao foco em formas truncadas. Nossas simulações de dinâmica molecular (MD) em um modelo de membrana plasmática de planta mostram que a fosforilação na região do linker controla o posicionamento do domínio RGS via ligações de hidrogênio com resíduos do RGSbox. Este mecanismo, consistente no fosfo-mutante S278E, também é observado em lycophytes, sugerindo um padrão regulatório conservado. Ensaios in vivo de Split Firefly Luciferase (SFluc) revelaram que o mutante S278E, mimetizando a fosforilação de S278, exibe interação reduzida com AtGPA1 em comparação com o tipo selvagem. Análises adicionais de MD e SFluc com vários mutantes fosfomiméticos de ambas as proteínas indicaram que a fosforilação simultânea de S278 em AtRGS1 e Y166 em AtGPA1 é necessária para uma interação estável, apontando para uma complexa relação de eventos de fosforilação na regulação da proteína G em plantas. Nossas descobertas também demonstram que a fosforilação de S278 é um modulador crucial nos processos de internalização, estabilidade e translocação nuclear. Assim, o resíduo S278 desempenha um papel importante na resposta do sistema imunológico anti- bacteriano. Coletivamente, esses resultados sugerem que o padrão de fosforilação de AtRGS1, especialmente S278 e do cluster, age como um código de barras direcionando respostas de vários elicitadores, influenciando o posicionamento do domínio da membrana e os processos gerais de sinalização. Palavras-chave: UPR; Estresse do ER; Morte celular programada; RGS1; Sinalização G; Fosforilação; Estrutura; Internalização.