Bioquímica Agrícola
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Item Caracterização bioquímica da aldeído desidrogenase GmTP55 da soja (Glycine max)(Universidade Federal de Viçosa, 2007-03-21) Soares, Ana Paula Gomes; Fietto, Luciano Gomes; http://buscatextual.cnpq.br/buscatextual/visualizacv.do?id=K4763824H8; Pereira, Maria Cristina Baracat; http://buscatextual.cnpq.br/buscatextual/visualizacv.do?id=K4780021E6; Fontes, Elizabeth Pacheco Batista; http://buscatextual.cnpq.br/buscatextual/visualizacv.do?id=K4781848H2; http://lattes.cnpq.br/3631825469916595; Fietto, Juliana Lopes Rangel; http://buscatextual.cnpq.br/buscatextual/visualizacv.do?id=K4790238D0; Moraes, George Henrique Kling de; http://buscatextual.cnpq.br/buscatextual/visualizacv.do?id=K4721569T7A proteína GmTP55 (Glycine max turgor protein) pertence à família ALDH7, das superfamílias das aldeído desidrogenases (ALDH). As proteínas desta família apresentam estrutura primária conservada e têm sido identificadas por se acumularem em plantas submetidas a condições de estresse abiótico. Embora elas tenham sido identificadas em diversos organismos, às funções fisiológica e bioquímica das proteínas da família ALDH7 ainda não foi elucidada. Além de compartilhar uma alta conservação de estrutura primária com outros membros da família ALDH, GmTP55 possui diversos domínios e aminoácidos conservados em posições, característicos de enzimas aldeído desidrogenases. A fim de confirmar sua atividade enzimática, a proteína GmTP55 foi expressa em sistema heterólogo procarioto de expressão e a atividade da proteína recombinante foi testada usando diversos aldeídos como substratos em potencial. A proteína GmTP55 apresentou maior atividade sobre aldeídos alifáticos de cadeia curta como propionaldeído, acetaldeído, γ-aminobutiraldeído e formaldeído, oxidando-os a ácidos carboxílicos na presença de NAD+. Dentre os aldeídos oxidados, o γ-aminobutiraldeido e formaldeído podem ser considerados como substratos fisiológicos potenciais para GmTP55, visto que estes aldeídos são produzidos como resultado da peroxidação de lipídios que ocorre durante a imposição de estresse celular oxidativo. A análise da função fisiológica da proteína GmTP55 foi realizada com plantas de Arabidopsis thaliana expressando ectopicamente o gene GmTP55. As plantas transgênicas obtidas, expressando constitutivamente a proteína, tiveram suas sementes plaqueadas em condições de estresse salino. Nestas condições, as plantas transgênicas apresentaram maior eficiência de germinação do que as plantas não transformadas. Coletivamente, estes resultados sugerem que a proteína GmTP55 está envolvida na tolerância das plantas a estresses abióticos, atuando em vias de detoxificação celular de aldeídos reativos derivados de peroxidação de lipídios.Item Purificação e caracterização de α-galactosidases do fungo Penicillium griseoroseum para utilização na hidrólise de oligossacarídeos de rafinose em derivados de soja(Universidade Federal de Viçosa, 2007-02-28) Falkoski, Daniel Luciano; Queiroz, Marisa Vieira de; http://buscatextual.cnpq.br/buscatextual/visualizacv.do?id=K4785812Z5; Oliveira, Maria Goreti de Almeida; http://buscatextual.cnpq.br/buscatextual/visualizacv.do?id=K4790894D6; http://lattes.cnpq.br/7062387416309293; Barros, Everaldo Gonçalves de; http://buscatextual.cnpq.br/buscatextual/visualizacv.do?id=K4781285J6; Fietto, Juliana Lopes Rangel; http://buscatextual.cnpq.br/buscatextual/visualizacv.do?id=K4790238D0; Castro, Ieso de Miranda; http://buscatextual.cnpq.br/buscatextual/visualizacv.do?id=K4787281A9O objetivo deste trabalho foi avaliar a eficiência das α-galactosidases purificadas do fungo Penicillium griseoroseum na hidrólise dos RO presentes no extrato desengordurado de soja. Penicillium griseoroseum foi cultivado em meio mineral, contendo galactomanana como fonte de carbono, por 120 h, a 28 oC. Após este período, o meio foi centrifugado, dialisado e utilizado como fonte de enzimas α-galactosidases. Os extratos enzimáticos foram submetidos à cromatografia de troca iônica em DEAE-Sepharose, pH 5,0. A eluição das proteínas que aderiram a resina foi feita com um gradiente de NaCl de 0 a 0,3 M, sendo detectado dois picos protéicos distintos contendo atividade α-galactosidase, sendo a enzima detectada o primeiro pico protéico eluído denominada α-Gal I e enzima eluída no segundo pico denominada α-Gal II. As frações contendo as enzimas α-Gal I e α-Gal II foram reunidas, concentradas por ultrafiltração e submetidas a uma eletroforese em gel de poliacrilamida, sob condições não desnaturantes. Ao termino das corridas eletroforéticas, os géis foram incubados em uma solução de ρ-NP-αGal (4 mg.mL-1) para determinar a localização das enzimas α-galactosidases. As regiões dos géis contendo as enzimas α-Gal I e α-Gal II, foram recortadas, maceradas e submetidas a agitação em tampão acetato de sódio, pH 5, 100 mM para extração e obtenção das enzimas purificadas. As enzimas α-Gal I e α-Gal II tiveram fatores de purificação de 155 e 53 vezes, respectivamente, com um rendimento final de 38 e 9 %, respectivamente. Atividades máximas de ambas as enzimas foram detectadas em pH 5,0 a 45oC. Os valores de meia vida da enzima α-Gal I a 40 e 45°C foram de 16 e 0,66 h respectivamente. Os valores de meia-vida da enzima α-Gal II a 40 e 45°C foram de 3,8 e 0,25 h respectivamente. Os valores da KM para ρ-NP-αGal, ο-PN-αGal, melibiose, estaquiose e rafinose para a enzima α-Gal I foram de 1,06, 1,31, 4,77, 19,99 e 28,74 mM, respectivamente, enquanto que, para a enzima α-Gal II foram de 0,80, 1,26, 5,10, 21,74 e 30,46 mM, respectivamente. As α-galactosidases apresentaram especificidade absoluta para galactose em posição α, hidrolisando os substratos sintéticos ρ-NP-αGal, ο-NP-αGal, estaquiose, rafinose, melibiose. Sulfato de cobre, sulfato de ferro e cloreto de mercúrio inativaram completamente as α-galactosidases quando presentes em concentrações iguais 1 mM no meio de reação. Os resultados dos tratamentos de extrato desengordurado de soja com as enzimas α-Gal I e α-Gal mostraram uma redução de 100% de estaquiose pós-incubação a 40 oC, por 8 h. Houve redução de 69 e 12 % da rafinose após 8 h de incubação, a 40 oC, com as enzima α-Gal I e α-Gal II, respectivamente. A enzima α-Gal I foi imobilizada em suporte insolúvel (sílica modificada) e utilizada em ensaios de hidrólise de RO contidos em extrato desengordurado de soja, sendo verificado uma redução de 100 e 70% de estaquiose e rafinose, respectivamente, após 8 h de incubação. A enzima α-Gal I foi reutilizada 8 vezes consecutivas, em ensaios de hidrólise de RO, não sendo detectada nenhuma perda de atividade enzimática. Observa-se que as α-galactosidases de P. griseoroseum foram eficientes na redução dos RO presentes em produtos derivados de soja, sendo indicadas para a utilização industrial no processamento desses açúcares.Item Construção de cassetes de expressão para silenciamento de genes da biossíntese de ácidos graxos em soja via RNA de interferência(Universidade Federal de Viçosa, 2007-02-28) Sousa, Cassiana Severiano de; Barros, Everaldo Gonçalves de; http://buscatextual.cnpq.br/buscatextual/visualizacv.do?id=K4781285J6; Oliveira, Luiz Orlando de; http://buscatextual.cnpq.br/buscatextual/visualizacv.do?id=K4781626T2; Moreira, Maurílio Alves; http://buscatextual.cnpq.br/buscatextual/visualizacv.do?id=K4796105P2; http://lattes.cnpq.br/2126288732219018; Ribon, Andréa de Oliveira Barros; http://buscatextual.cnpq.br/buscatextual/visualizacv.do?id=K4727026E6; Lima, Andréia Barcelos Passos; http://buscatextual.cnpq.br/buscatextual/visualizacv.do?id=K4766019H4O óleo de soja é composto em sua maior parte por gordura insaturada, sendo que os ácidos graxos polinsaturados (ácidos linoléico e linolênico), monoinsaturado (ácido oléico) e saturados (ácido palmítico e esteárico) correspondem, em média, a 61%, 25% e 15%, respectivamente. Alterações nas proporções relativas destes ácidos graxos na fração óleo, podem ser obtidas pela modificação genética da expressão de enzimas-chave da biossíntese de ácidos graxos polinsaturados, através de transformação genética de plantas via silenciamento gênico. Dentre essas enzimas, destacam-se as dessaturases, as fosfotransferases e as aciltransferases. Através da modificação da expressão dessas enzimas, é possível a obtenção de linhagens de soja com óleos com menor conteúdo de ácido linolênico, maior conteúdo de ácido oléico e, conseqüentemente, maior estabilidade oxidativa. Os objetivos deste trabalho foram isolar os fragmentos dos genes da oleoil dessaturase, 1,2-diacilglicerol colinafosfotransferase e lisofosfatidilcolina aciltransferase e construir cassetes de expressão para o silenciamento, via RNA de interferência, para esses três genes em sementes de soja. Foi possível isolar os fragmentos dos três genes, subclonar os fragmentos sense e antisense no vetor pKANNIBAL e transferir as construções para o vetor binário pCAMBIA 3301. Foram obtidos quatro cassetes de expressão para silenciamento gênico. Destes, dois foram para o gene da oleoil dessaturase, um para o gene da 1,2-diacilglicerol colinafosfotransferase e o outro para o gene da lisofosfatidilcolina aciltransferase. Para os três genes foram obtidos cassetes de silenciamento dirigidos pelo promotor 35SCaMV, sendo que para a dessaturase também foi obtido o cassete com o promotor do gene da subunidade α da proteína de reserva de soja β-conglicinina.Item Identificação de fatores de transcrição que controlam a expressão do gene GmASR3 de soja(Universidade Federal de Viçosa, 2012-07-23) Dadalto, Silvana Pinheiro; Ramos, Juliana Rocha Lopes Soares; http://buscatextual.cnpq.br/buscatextual/visualizacv.do?id=K4790613J3; Fontes, Elizabeth Pacheco Batista; http://buscatextual.cnpq.br/buscatextual/visualizacv.do?id=K4781848H2; Fietto, Luciano Gomes; http://buscatextual.cnpq.br/buscatextual/visualizacv.do?id=K4763824H8; http://lattes.cnpq.br/0685179668761044; Loureiro, Marcelo Ehlers; http://buscatextual.cnpq.br/buscatextual/visualizacv.do?id=K4780851Y3Proteínas ASR (ABA, Stress and ripening induced protein) são induzidas em situações de estresses, maturação ou na presença de ABA, em diversas espécies vegetais, como Lírio (Lilium longiflorum); cana de açúcar (Saccharum officinarum); uva (Vitis vinífera); arroz (Oriza sativa); petúnia, banana (Musa acuminata e Musa balbisiana) e milho (Zea mays), entre outros. No entanto nenhum gene ASR foi encontrado em Arabidopsis. ASRs são proteínas pequenas, hidrofílicas e sem estrutura definida. Sua função é desconhecida, assim como a via de sinalização a qual pertencem. Em soja foi relatada a presença de três ASRs, que foram denominadas GmASR1, GmASR2 e GmASR3. Este trabalho buscou identificar proteínas que interagem com a região promotora de GmASR3, assim como fatores que se ligam à proteína GmASR3. Após analise em bancos de dados, a região promotora em torno de 500pb a montante do códon de iniciação da transcrição foi obtida a partir de PCR realizado com o DNA genômico de soja (Glycine max, cultivar CD206) e clonado em plasmídeo pHIS2.1. Esta construção foi transformada em leveduras S. cerevisiae W303 para posterior triagem líquida de cDNAs que expressam fatores capazes de interagir com o promotor de GmASR3, a partir do método do mono-híbrido de leveduras. Foi verificado que a proteína GmASR3 possui fraca capacidade de transativação nas condições utilizadas, o que possibilitou a realização de experimentos de duplo-híbrido com o fim de identificar fatores que se ligam à proteína GmASR3. Os fatores que se ligam a GmASR3 foram obtidos através do método do duplo-híbrido de leveduras, utilizando para isso leveduras S. cerevisiae AH109 portadoras do plasmídeo pDest32 ao qual foi inserido a sequencia do cDNA de GmASR3. As triagens de mono e duplo-híbrido foram realizadas utilizando o método da triagem líquida em placas deep well. As colônias que foram consideradas portadoras dos fatores que interagem com o promotor ou com a proteína GmASR foram retransformados em E. coli Dh5α e enviados para sequenciamento.Item Identificação de GmERD 15, um novo fator de transcrição que controla a expressão do gene GmNRP-B em soja(Universidade Federal de Viçosa, 2010-02-12) Alves, Murilo Siqueira; Fontes, Elizabeth Pacheco Batista; http://buscatextual.cnpq.br/buscatextual/visualizacv.do?id=K4781848H2; Carvalho, Claudine Márcia; http://buscatextual.cnpq.br/buscatextual/visualizacv.do?id=K4794965T6; Fietto, Luciano Gomes; http://buscatextual.cnpq.br/buscatextual/visualizacv.do?id=K4763824H8; http://lattes.cnpq.br/8216921216597311; Loureiro, Marcelo Ehlers; http://buscatextual.cnpq.br/buscatextual/visualizacv.do?id=K4780851Y3; Zerbini Júnior, Francisco Murilo; http://buscatextual.cnpq.br/buscatextual/visualizacv.do?id=K4783743U5Recentemente foi demonstrado através de experimentos de microarranjos de DNA que as vias de resposta aos estresses no retículo endoplasmático e osmótico convergem aumentando a expressão de um conjunto de genes coordenadamente regulados, dentre eles o gene GmNRP-B codifica uma proteína rica em asparagina e que está envolvida com eventos de morte celular programada em plantas. Este trabalho teve como objetivo principal a identificação e caracterização de fatores de transcrição que controlam a expressão de GmNRP-B, e que portanto constitui um importante componente da via integrativa dos estresses do retículo e osmótico. Para tanto a região promotora de GmNRP-B foi identificada em banco de dados e a partir dela foram construídas fusões de transcrição com os genes repórteres HIS3 e LacZ. Estas construções foram integradas no genoma de leveduras W303, resultando nos transformantes W303-pNRP-His/LacZ, que foram utilizadas como hospedeiras para transformação com uma biblioteca de cDNA de soja construída no vetor pEXP-AD502. Após a varredura da biblioteca, foram selecionados 9 clones, destes 9 apenas um manteve-se positivo após um novo evento de transformação. O sequenciamento do DNA do clone positivo e a comparação de sua seqüência com o banco de dados do Phytozome identificou um gene que codifica uma proteína similar a ERD15 de Arabidopsis. O gene de soja identificado foi denominado GmERD15 e a seqüência de aminoácidos deduzida mostrou que a proteína possui um domínio conservado de interação com proteínas que se ligam à cauda poli A de mRNAs (PABP). A busca por seqüências similares no banco dedados do Phytozome mostrou que o gene encontra-se duplicado no genoma da soja e que além dos dois genes outros 4 constituem esta família gênica em soja. A comparação da seqüência de aminoácidos deduzida com ortólogos ERD15 de diversos organismos mostrou que GmERD15 possui o domínio de interação com PABP conservado em sua porção amino-terminal e uma porção carboxi terminal divergente. A análise do agrupamento destas proteínas mostrou que podemos dividir esta família de proteínas em pelo menos 3 subfamílias sendo que GmERD15 encontra-se em uma subfamília separada da proteína de Arabidopsis. Para confirmar a interação da proteína GmERD15 com a região promotora de GmNRP-B foram realizadas deleções a partir do nucleotídeo -1000 do início de tradução originando fragmentos com 700 e 350 pares de bases. A análise destes promotores por monohíbrido em leveduras mostrou que esta proteína ativa fortemente a expressão de LacZ sob controle do promotor de GmNRP-B de 1000 e 700 pares de bases, porém esta ativação decai consideravelmente quando o promotor é deletado até aproximadamente 350 pares de bases, indicando uma grande perda de cis-elementos. Foi constatado também que GmERD 15 possui atividade de transativação em leveduras. Além disto a análise da sequência de aminoácidos mostrou a presença de um domínio de ativação transcricional na porção carboxi-terminal, e a expressão transiente de GmERD 15 em protoplastos de soja levou a um aumento da expressão de GmNRP-B. Quimeras de GmERD 15 com a proteína YFP expressas transientemente em folhas de tabaco localizam-se no citosol e no núcleo. Coletivamente, estes resultados indicam que GmERD 15 atua no controle da expressão do gene GmNRP-B revelando uma nova família de transfatores, que atuam nocontrole da expressão de genes em plantas.Item Correlação entre a expressão dos genes da subunidade α da β-conglicinina e GmFAD2-1A durante o desenvolvimento da semente de soja(Universidade Federal de Viçosa, 2010-02-25) Cunha, Pricila da Silva; Fietto, Luciano Gomes; http://buscatextual.cnpq.br/buscatextual/visualizacv.do?id=K4763824H8; Barros, Everaldo Gonçalves de; http://buscatextual.cnpq.br/buscatextual/visualizacv.do?id=K4781285J6; Moreira, Maurílio Alves; http://buscatextual.cnpq.br/buscatextual/visualizacv.do?id=K4796105P2; http://lattes.cnpq.br/2712020388620043; Fietto, Juliana Lopes Rangel; http://buscatextual.cnpq.br/buscatextual/visualizacv.do?id=K4790238D0; Oliveira, Márcia Rodrigues Carvalho; http://lattes.cnpq.br/0568726713111558O aumento no conteúdo de ácido oléico e diminuição nos níveis dos ácidos graxos polinsaturados (linolênico e linoléico) na semente de soja pode ser alcançado pela redução da atividade da enzima ω-6 dessaturase microssomal através do silenciamento do gene GmFAD2-1A que codifica para essa enzima, resultando na produção de óleos com elevada estabilidade oxidativa. O silenciamento deve ocorrer especificamente na semente de forma a não alterar as características agronômicas da planta e não interferir negativamente no seu crescimento e desenvolvimento. Para isso, o transgene deve estar sob controle de um promotor semente-específico como o promotor do gene da subunidade α da β-conglicinina (promotor pBC). O principal objetivo desse trabalho foi correlacionar o padrão de expressão do gene que codifica a subunidade α da β-conglicinina (gene BC) com o padrão de expressão do gene GmFAD2-1A ao longo do desenvolvimento da semente de soja em cinco variedades que diferem quanto ao teor protéico ("normal" e "alto") e ao ciclo de vida (precoce e tardio). E, através dessa correlação, analisar se opromotor pBC apresenta potencial para ser usado em futuros experimentos de transformação genética de soja que tenha como objetivo silenciar o gene GmFAD2-1A. A análise do padrão de expressão dos genes BC e GmFAD2-1A foi feita por PCR em Tempo Real (qRT-PCR) utilizando dois controles endógenos (GAPDH e EF1b). A subunidade α da β-conglicinina foi quantificada por SDSPAGE/ densitometria durante o desenvolvimento da semente em todos os cinco cultivares. De modo geral, a concentração da subunidade α daβ-conglicinina foi inferior em estádios iniciais de desenvolvimento da semente, aumentando em estádios do meio para o final da maturação, indicando que ocorreu um acúmulo desse polipeptídeo ao longo do enchimento do grão, e apresentando uma concentração alta e significativa na semente madura. As variedades de teor protéico "normal" apresentaram concentrações superiores da subunidade α quando comparadas com suas respectivas isolinhas de maiores teores protéicos, o que ocorreu em estádios do meio para o final da maturação. Os dois genes endógenos (GAPDH e EF1b) normalizaram os dados de expressão dos genes BC e GmFAD2-1A de modo muito similar, com as principais diferenças ocorrendo nos perfis de expressão dos dois genes alvos em estádios do meio e final da maturação nas variedades de ciclo precoce. Entretanto, GAPDH foi melhor normalizador do que EF1b, mostrando expressão mais estável entre todos os tratamentos. De modo geral, o gene BC apresentou maior padrão de expressão em estádios do início e meio da maturação da semente, sendo que nesses estádios pode-se sugerir que o promotor pBC atingiu sua capacidade máxima para ativar a transcrição do gene alvo, com a expressão do gene BC diminuindo em direção aos estádios finais de desenvolvimento da semente. Pode-se sugerir que essa diminuição na expressão do gene BC esteja associada à uma diminuição na atividade do promotor pBC, embora ele ainda permanecesse suficientemente ativo para garantir um nível alto de expressão do transgene em futuros experimentos transformação genética de soja. Nenhuma diferença significativa foi encontrada no padrão de expressão do gene BC quando se comparou uma variedade de soja e sua respectiva isolinha de maior teor protéico ao longo do desenvolvimento da semente. De modo geral, enquanto a concentração da subunidade α foi inferior em estádios iniciais da maturação (1° e 2°), o gene BC apresentou maior padrão de expressão em estádios do início e meio do desenvolvimento da semente (2° e 3°). A partir do 3° estádio em direção ao final da maturação, houve um aumento na concentração da subunidade α enquanto verificou-se uma diminuição na expressão do gene BC em vários desses estádios. A principal diferença foi encontrada na semente madura de todas as variedades que apresentou uma alta concentração do polipeptídeo, apesar de uma expressão quase nula do gene BC. De forma geral, não foi encontrado um padrão de expressão do gene BC e de concentração da subunidade α que permitisse diferenciar o grupo de variedades de ciclo tardio do grupo de ciclo precoce. Em relação ao gene GmFAD2-1A, de modo geral, as variedades de ciclo tardio apresentaram maior padrão de expressão gênica em estádios do meio para o final do desenvolvimento da semente, enquanto nos cultivares de ciclo precoce o gene GmFAD2-1A mostrou maior padrão de expressão em estádios do início e meio da maturação. Assim como para o gene BC a expressão de GmFAD2-1A foi quase nula na semente madura para todas as variedades. De modo geral, a correlação entre o padrão de expressão dos genes BC e GmFAD2-1A nas variedades de ciclo tardio mostrou que nos estádios em que houve maior taxa de transcrição do gene GmFAD2-1A a expressão do gene BC diminuiu após atingir um pico de expressão no 3° estádio. Entretanto, a expressão do gene BC foi ainda superior à do gene GmFAD2-1A nesses estádios. Dessa forma, para os cultivares de ciclo tardio, nos estádios em que o gene GmFAD2-1A apresentou os maiores valores de expressão pode-se sugerir que o promotor pBC está ativo ou com uma capacidade máxima para ativar a transcrição do gene alvo. Nos cultivares de ciclo precoce essa correlação mostrou que os genes BC e GmFAD2-1A apresentaram um padrão de expressão semelhante, com valores elevados de expressão gênica em estádios do início e meio da maturação (2° e 3°), diminuindo em estádios posteriores de desenvolvimento da semente. Portanto, pode-se sugerir que a maior atividade do promotor pBC ocorreu nos mesmos estádios em que foram encontrados os maiores valores de expressão do gene GmFAD2-1A. Dessa forma, pode-se sugerir que o promotor do gene da subunidade α daβ-conglicinina apresenta elevado potencial para ser usado em futuros experimentos de transformação genética que tenha como objetivo silenciar o gene GmFAD2-1A ao longo do desenvolvimento da semente de soja em todos os cultivares analisados.Item Caracterização funcional do fator de transcrição GmNAC6 de soja (Glycine max) e padrão de expressão de genes GmNACs em resposta a estímulos bióticos(Universidade Federal de Viçosa, 2009-07-31) Faria, Jerusa Araújo Quintão Arantes; Fietto, Luciano Gomes; http://buscatextual.cnpq.br/buscatextual/visualizacv.do?id=K4763824H8; Loureiro, Marcelo Ehlers; http://buscatextual.cnpq.br/buscatextual/visualizacv.do?id=K4780851Y3; Fontes, Elizabeth Pacheco Batista; http://buscatextual.cnpq.br/buscatextual/visualizacv.do?id=K4781848H2; http://lattes.cnpq.br/4094701424279023; Carvalho, Claudine Márcia; http://buscatextual.cnpq.br/buscatextual/visualizacv.do?id=K4794965T6; Ribon, Andréa de Oliveira Barros; http://buscatextual.cnpq.br/buscatextual/visualizacv.do?id=K4727026E6Os fatores de transcrição da família NAC são específicos de plantas e atuam em eventos de desenvolvimento e resposta de defesa. Além dos sete genes NACs previamente caracterizados (GmNAC1-GmNAC6 e GmATAF), quatro novos genes desta família (Gm82, Gm119, Gm178 e Gm258) foram avaliados em resposta a condições de estresse biótico. GmATAF, GmNAC3 e GmNAC4 foram induzidos por fatores comuns à patogênese, como ferimento e inoculação de patógenos (interações compatíveis e incompatíveis). GmNAC1 respondeu transientemente à injúria mecânica das folhas. Gm82 foi induzido durante a resposta hipersensível e sistêmica, enquanto que Gm119 foi induzido por interações compatível e incompatível. Em contrapartida, GmNAC2 e GmNAC5 não foram regulados transcricionalmente por estímulos bióticos. Expressão de GmNAC6 resultou em morte celular em folhas de tabaco, evidenciada pelo desenvolvimento de necrose foliar, perda de clorofila, peroxidação de lipídeos e indução de genes PRs . Em concordância com a presença de elementos putativos relacionados à defesa na região promotora de GmNAC6, este transfator foi induzido por ferimento, patógeno incompatível e na resposta sistêmica. Superexpressão de NRP-A e NRP-B, os quais são envolvidos no processo de morte celular, resultou no aumento de transcritos de GmNAC6. Estes resultados foram consistentes com a cinética de indução precoce de NRPs em comparação com a resposta tardia de GmNAC6 a patógenos. Entretanto, expressão transiente de GmNAC6 em protoplastos de soja reprimiu a expressão de NRP-A. Coletivamente, estes resultados implicam GmNAC6 como componente da via de sinalização de morte celular em soja mediada por NRPs. Experimentos adicionais deverão ser conduzidos para elucidar a sinalização envolvendo NRPs e GmNAC6.Item Análises biométricas da produtividade, composição de açúcares solúveis e polissacarídeos não-amídicos (PNAs) na seleção de genótipos de soja(Universidade Federal de Viçosa, 2009-02-17) Bueno, Rafael Delmond; Barros, Everaldo Gonçalves de; http://buscatextual.cnpq.br/buscatextual/visualizacv.do?id=K4781285J6; Oliveira, Maria Goreti de Almeida; http://buscatextual.cnpq.br/buscatextual/visualizacv.do?id=K4790894D6; Moreira, Maurílio Alves; http://buscatextual.cnpq.br/buscatextual/visualizacv.do?id=K4796105P2; http://lattes.cnpq.br/5163173387452113; Piovesan, Newton Deniz; http://buscatextual.cnpq.br/buscatextual/visualizacv.do?id=K4728400U5; God, Pedro Ivo Vieira Good; http://buscatextual.cnpq.br/buscatextual/visualizacv.do?id=K4769361T9; Guimarães, Valéria Monteze; http://buscatextual.cnpq.br/buscatextual/visualizacv.do?id=K4798758T3A soja é um grão de alto valor nutricional, é utilizada como base para vários produtos, portanto existe uma demanda crescente por genótipos de soja com alta produtividade e características de qualidade específicas. Assim, torna-se importante a caracterização de genótipos de soja quanto aos componentes bioquímicos relativos à qualidade e também quanto aos fatores antinutricionais, os quais limitam o uso da soja na alimentação humana e de animais monogástricos. Este trabalho teve os seguintes objetivos gerais; avaliar a interação genótipo x ambiente quanto à produtividade e as concentrações de proteína, sacarose, rafinose e estaquiose em soja; estimar as correlações entre caracteres analisados no presente trabalho; selecionar genótipos de soja, os quais poderão ser utilizados em programas que visam aumentar a qualidade nutricional do grão de soja, visando o uso na alimentação humana e de animais monogástrico. Para isto, foram avaliados 18 genótipos de soja, cultivados nas estações experimentais da COOPADAP situadas nos Municípios de Mineiros-GO, Perdizes-MG, São Gotardo-MG e Presidente Olegário-MG, no ano agrícola 2005/2006. Os experimentos foram executados em blocos casualizados, com três repetições. Foi determinada a produtividade média (Kg ha-1) dos 18 genótipos nos quatro ambientes, assim como, as concentrações: de proteína utilizando um espectrômetro infravermelho (NIR); sacarose, rafinose e estaquiose por HPLC. As análises estatísticas foram realizadas com o auxílio do aplicativo computacional em genética e estatística, Programa GENES. Na análise de variância conjunta, verificaramse efeitos significativos para ambiente e genótipo x ambiente (p<0,01), para todas as cinco características avaliadas. Foram detectados efeitos significativos de genótipo (p<0,01) para produtividade e proteína e (p<0,05) para sacarose e rafinose. As análises de adaptabilidade e estabilidade foram realizadas utilizando-se o método de Lin e Binns (1988) modificado por Carneiro (1998) e método de Centróide. Os dois métodos empregados mostraram coerência e permitiram identificar os genótipos mais estáveis e responsivos a melhoria do ambiente como sendo também os que apresentaram maior produtividade e maiores concentrações de proteína, sacarose, rafinose e estaquiose. Os genótipos que se destacaram pela ampla adaptabilidade segundo as duas metodologias empregadas no presente trabalho foram; considerando a variável produtividade, as cultivares VENCEDORA e MSOY 8001; para concentração de proteína, a cultivar ELITE; para concentração de sacarose, a linhagem CS 01 736; para a concentração de rafinose, a linhagem CS 02 988 e para a concentração de estaquiose, a cultivar MSOY 8001. Produtividade e concentração de proteína apresentaram correlação negativa, o que mostra que a seleção para um determinado caráter pode provocar o declínio do outro. A correlação entre a produtividade e concentração de sacarose não foi significativa. O mesmo comportamento foi observado entre a concentração de proteína vs concentração de sacarose e entre a concentração de proteína vs concentração de estaquiose. O fato desses caracteres não estarem correlacionados facilita a seleção de genótipos com alta concentração de sacarose e alta produtividade, ou ainda, genótipos com altas concentrações de sacarose e proteína. A correlação entre produtividade vs concentração de rafinose e produtividade vs concentração de estaquiose foram negativas e significativas, essa correlação negativa e significativa facilita a seleção de genótipos com alta produtividade e com baixas concentrações de rafinose e estaquiose. A concentração de sacarose apresentou altos e positivos coeficientes de correlação com as concentrações de rafinose e estaquiose, indicando a impossibilidade de se fazer à seleção direta de indivíduos com alta concentração de sacarose e baixas concentrações de rafinose e estaquiose. A segunda parte do presente trabalho foi realizada utilizando seis genótipos de soja cultivados no Município de Mineiros-GO. Foi demonstrado que a metodologia adaptada para quantificar fatores antinutricionais termoestáveis, tais como, os Polissacarídeos não-amídicos em soja, utilizando a técnica cromatográfica HPLC, se mostrou de boa precisão. Não foi encontrada correlações significativas entre Produtividade vs PNAs,Óleo vs PNAs e Proteína vs PNAs entre os seis genótipos analisados. O fato desses caracteres não estarem correlacionados facilita a seleção de genótipos com melhor qualidade nutricional, pois possibilita ao melhorista diminuir os conteúdos de PNAs totais, PNAs insolúveis e principalmente os PNAs solúveis, sem afetar a produtividade e as concentrações de óleo ou de proteína. As variáveis produtividade e concentração de óleo apresentaram altos e positivos coeficientes de correlação com as concentrações de carboidratos totais e açucares solúveis, indicando a dificuldade de se fazer a seleção direta de indivíduos com alta produtividade ou altas concentrações de óleo e ao mesmo tempo, com baixas concentrações de carboidratos totais e açucares solúveis. Proteína correlacionou-se negativamente com as concentrações de carboidratos totais e açucares solúveis, esse resultado favorece a seleção de genótipos com altas concentrações de proteína e com baixas concentrações de carboidratos totais e açucares solúveis.Item Identificação e validação de marcadores moleculares indel e SNP para lipoxigenases de sementes de soja(Universidade Federal de Viçosa, 2009-07-06) Silva, Danielle Fernandes da; Barros, Everaldo Gonçalves de; http://buscatextual.cnpq.br/buscatextual/visualizacv.do?id=K4781285J6; Oliveira, Luiz Orlando de; http://buscatextual.cnpq.br/buscatextual/visualizacv.do?id=K4781626T2; Moreira, Maurílio Alves; http://buscatextual.cnpq.br/buscatextual/visualizacv.do?id=K4796105P2; http://lattes.cnpq.br/7918289438245309; Miranda, Fábio Demolinari de; http://buscatextual.cnpq.br/buscatextual/visualizacv.do?id=K4706159T4; Schuster, Ivan; http://lattes.cnpq.br/9991337319211428; Moraes, Rita Maria Alves de; http://lattes.cnpq.br/2396993596781287A degradação oxidativa dos ácidos graxos da fração óleo de soja, que ocorre durante o processamento dos grãos, desenvolve o sabor de feijão cru que altera a palatabilidade e conseqüentemente aceitabilidade dos produtos à base de soja, resultando em problemas para a indústria de alimentos. A enzima lipoxigenase (linoleato: O2 oxirredutase, EC 1.13.11.12), catalizadora dessa reação oxidativa, está presente na semente de soja sob a forma de três isoenzimas codificadas por três genes dominantes, Lox1, Lox2 e Lox3. A seleção assistida por marcadores moleculares é uma área que possui grande impacto dentro dos programas de melhoramento. Recentemente, uma nova classe de marcadores moleculares, denominados indel (Inserção/deleção) e SNP (Single Nucleotide Polymorphism), vem sendo utilizada. Estes se baseiam na detecção de polimorfismos resultantes da alteração de uma única base no genoma. A identificação de marcadores moleculares dentro dos genes que codificam as lipoxigenases poderá auxiliar na seleção de alelos recessivos que determinam a ausência de lipoxigenases na semente, acelerando assim o processo de melhoramento da soja. Os objetivos desse trabalho foram a confirmação e identificação de polimorfismos presentes nas seqüências dos genes que codificam as lipoxigenases 2 e 3, respectivamente; entre variedades, de origem genética distintas, utilizadas no Programa de Melhoramento da Qualidade da Soja-BIOAGRO/UFV e validação de alguns desses polimorfismos como marcadores moleculares. Um par de primers para a LOX2 e 14 pares de primers desenhados para amplificar todo o gene da LOX3, foram utilizados para a obtenção dos fragmentos dos genes. As seqüências foram obtidas a partir do seqüenciamento direto dos produtos de PCR de cada par de primer. Posteriormente, uma população de RILs contrastantes para presença/ausência das lipoxigenases das sementes, foi utilizada para a validação de dois SNPs como marcadores dos genes LOX 2 e um indel como marcador para LOX 3. O método de genotipagem usado foi o seqüenciamento direto dos fragmentos que continham os polimorfismos em estudo. Dois SNPs para LOX 2 e o indel contido no primeiro éxon do gene LOX 3 co-segregaram com o caráter presença/ausência de LOX 2 e 3 respectivamente nos indivíduos da população de RILs. Esses polimorfismos têm potencial para serem utilizados como ferramentas no melhoramento da soja assistido por marcadores moleculares.Item Propriedades bioquímicas e cinético-enzimáticas de cisteíno- proteases do intestino médio da lagarta da soja(Universidade Federal de Viçosa, 2008-02-27) Mendonça, Eduardo Gomes de; Oliveira, Joel Antônio de; http://buscatextual.cnpq.br/buscatextual/visualizacv.do?id=K4707224A0; Oliveira, Maria Goreti de Almeida; http://buscatextual.cnpq.br/buscatextual/visualizacv.do?id=K4790894D6; Guedes, Raul Narciso Carvalho; http://buscatextual.cnpq.br/buscatextual/visualizacv.do?id=K4721108T2; http://lattes.cnpq.br/8989382342757236; Moreira, Maurílio Alves; http://buscatextual.cnpq.br/buscatextual/visualizacv.do?id=K4796105P2; Oliveira, Tânia Toledo de; http://buscatextual.cnpq.br/buscatextual/visualizacv.do?id=K4787758J2; Brumano, Maria Helena Nasser; http://buscatextual.cnpq.br/buscatextual/visualizacv.do?id=K4791952U3Inibidores de protease que atuam em proteases específicas de insetos são candidatos para terem seus códigos genéticos inseridos em plantas geneticamente modificadas. Um primeiro passo para se alcançar isso é a caracterização das enzimas proteolíticas do intestino desses insetos. Cisteíno-proteases da Fração solúvel e da Fração insolúvel do intestino médio de Anticarsia gemmatalis foram caracterizadas utilizando o substrato L-BApNA. A Fração solúvel, chamada de Fração I, foi obtida do sobrenadante após nove ciclos de congelamento e descongelamento do intestino de A. gemmatalis e a Fração insolúvel, chamada de Fração II, obtida da maceração com o detergente Brij 35 do pellet resultante da Fração I. Verificaram-se dois valores de pH com pronunciada atividade em ambas as Frações, sendo eles pH 3,6 e 8,0 para a Fração I e 4,6 e 8,0 para a Fração II. Já o pico de atividade quando testada a influência da temperatura foi em 35oC para a Fração I e 60°C para a Fração II. O KM app encontrado para as Frações I e II foram de 2,28 mM e 0,44 mM respectivamente. A Vmáx app para as respectivas Frações foram 297,68 nM.s-1 e 122,95 nM.s-1. Quatro inibidores de proteases foram testados, sendo cada um deles de uma classe de protease: TLCK (inibidor de serino-protease), E-64 (inibidor de cisteíno-protease), EDTA (inibidor de metaloprotease) e Pepstatina A (inibidor de aspartil- protease). A inibição mais pronunciada foi verificada quando E-64 foi adicionado ao meio para ambas as Frações, uma vez que todas as concentrações testadas diminuíram significativamente a atividade de cisteíno-protease. Um aumento de TLCK no meio fez com que a atividade de cisteíno-protease caísse gradativamente devido à reação desse com resíduo de aminoácido histidina na tríade catalítica, o qual faz parte de tríade de cisteíno-protease também. O efeito de EDTA na atividade de cisteíno-protease de A. gemmatalis sobre L-BApNA mostra a diferença entre as duas Frações analisadas. A Fração I não depende de íons divalentes como Ca2+ para sua atividade. Já a Fração II é cálcio-dependente, pois EDTA diminuiu significativamente sua atividade. Pespstatina A não influenciou cisteíno-proteases da Fração I, exercendo pouca influência na Fração II.
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