Bioquímica Agrícola
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Item Efeitos do flavonóide crisina, xantona e das proteínas de soja e caseína no peso corporal e nos lipídeos sanguíneos e hepáticos de coelhos(Universidade Federal de Viçosa, 2002-02-25) Percegoni, Nathércia; Oliveira, Tânia Toledo de; http://lattes.cnpq.br/2603277277832046As anormalidades lipídicas são de grande importância, devido a sua ligação com a doença vascular aterosclerótica e com a doença cardíaca coronariana. Assim, objetivou-se comparar os efeitos da ingestão do flavonóide crisina, xantona, caseína e proteína de soja sobre a diminuição do colesterol e suas frações, triglicerídeos e glicose, sorológicos, deposição lipídica no tecido hepático e redução do peso corporal total. Coelhos da raça albino foram divididos durante 30 dias nos seguintes grupos: colesterol + ácido cólico + ração (hipercolesterolêmicos) e ração pura (controle), em todos os três experimentos, sendo que no primeiro experimento houveram mais 2 grupos, um para colestiramina e outro para crisina, no segundo experimento, um para caseína, um para proteimax e outro para colestiramina e, no terceiro experimento, um para xantona, além daqueles mencionados anteriormente. Os níveis de colesterol plasmático, triglicerídeos, LDL-c e HDL-c foram medidos, no 16° e 31° dias de experimento, utilizando kits enzimáticos e os resultados foram expressos em mg/dL. Foram analisadas amostras de tecido hepático, sendo os cortes fixados em historesina e paraplast. Observou-se a indução significativa de hipercolesterolemia nos animais que receberam ração + colesterol + acido cólico. Foi verificada redução nas taxas de colesterol, LDL-c, HDL-c, triacilgliceróis e glicose, menor deposição de gotículas de gordura nos hepatócitos bem como uma redução no peso corporal nos animais que receberam crisina. Conclui-se que a ingestão do flavonóide crisina exerceu proteção contra o aumento do colesterol plasmático e a deposição de triacilgliceróis nos hepatócitos evitando a esteatose e, conseqüente, degeneração hepática. Ainda, exerceu um efeito preventivo no ganho de peso corporal total. No segundo experimento, verificou-se maior aumento de colesterol, LDL-c e triglicerídeos no grupo que recebeu caseína, bem como maior deposição de gotículas de gordura nos hepatócitos, em comparação com o grupo que recebeu proteimax. Em contrapartida, houve aumento proporcional aos níveis de colesterol total nos níveis de HDL para o grupo que recebeu proteimax. Observou-se ainda redução no peso corporal total desencadeado pela proteína de soja. Verificou-se que a ingestão de maior quantidade de proteína vegetal na dieta em substituição a proteína animal, pode ser um fator de prevenção ao ganho de peso corporal, aumento do colesterol plasmático e a deposição de triacilgliceróis nos hepatócitos, levando à esteatose e a conseqüente degeneração hepática. No terceiro experimento, verificou-se um acréscimo nas taxas de colesterol, LDL- c, HDL-c e glicose no grupo que recebeu xantona, e decréscimo nas taxas de triacilgliceróis para este grupo. Não se verificou acúmulo de gotículas de gordura nos hepatócitos para este grupo, mas observou-se a ocorrência de múltiplas lesões focais nestas células. A xantona provocou redução no peso corporal total. Conclui-se que a ingestão de xantonas exerce proteção contra a elevação do peso corpóreo e da concentração de triacilgliceróis sanguíneosItem Caracterização de α -galactosidase de soja para hidrólise de oligossacarídeos de rafinose(Universidade Federal de Viçosa, 2002-02-28) Viana, Simone de Fátima; Rezende, Sebastião Tavares de; http://lattes.cnpq.br/4767669584583840A ingestão de grãos de leguminosas, como a soja e derivados, resulta no aparecimento de sintomas desagradáveis, o que limita o seu consumo. Dentre os sintomas desagradáveis, destaca-se a flatulência, que é resultante do metabolismo anaeróbico de α-1,6-galactosídeos de rafinose (RO: oligossacarídeos de rafinose) presentes nos grãos das leguminosas em geral. A remoção desses açúcares das sementes ou do extrato hidrossolúvel poderia aumentar o consumo de alimentos derivados de soja. Vários processos para redução do conteúdo de RO em derivados de soja já foram descritos; entretanto, a hidrólise enzimática dos RO, catalisada por α-galactosidases, parece ser o mais promissor. O objetivo deste trabalho foi verificar a eficiência da α-galactosidase de sementes de soja em germinação para hidrolisar os RO presentes no extrato de soja. Sementes de soja (Glycine max , vr. CAC-1) foram germinadas por 60 h, a 27 °C. O extrato enzimático foi obtido pela trituração das sementes em tampão citrato/fosfato de sódio, pH 5,0. A suspensão foi filtrada e centrifugada, e o extrato enzimático resultante, utilizado para a purificação da α-galactosidase. Em uma primeira abordagem, o extrato enzimático foi fracionado em um sistema de duas fases aquosas (SDFA), formado por uma mistura de 16% (p/p) de PEG 1500, 16% (p/p) de fosfato de sódio pH 5,0 e 12% (p/p) de NaCl. A enzima presente na fase superior do SDFA foi dialisada e submetida à cromatografia de troca iônica em coluna de CM-Sepharose, pH 4,0. As frações com atividade de α-galactosidase, eluídas com um gradiente de NaCl (0-0,8M), foram reunidas, concentradas por ultrafiltração, originando a α-galactosidase semi-purificada. A α-galactosidase foi purificada 12,4 vezes e o rendimento do processo de purificação foi de 13,5%. Atividade máxima de α-galactosidase foi detectada em pH 5-6 a 50 °C. A enzima manteve-se em torno de 100% da atividade original após pré- incubação por 3 h, a 35 e 40 °C, mas somente 50% da atividade original foi mantida após pré-incubação a 45 °C. K M ap para ρNPGal, melibiose e rafinose determinados pelo método do duplo-recíproco foram de 0,30 mM, 0,63 mM e 6,16 mM, respectivamente. A enzima hidrolisou com maior intensidade rafinose, seguido de ρNPGal, estaquiose e melibiose. Galactose, rafinose, melibiose, CuSO 4 , SDS e CAC-1l 2 atuaram como inibidores da atividade da enzima parcialmente purificada. Resultados do tratamento do leite de soja com a enzima mostraram redução de 72,3% de estaquiose e 89,2% de rafinose após um período de incubação de 6h, a 40 °C. Com o objetivo de aumentar o rendimento do processo de purificação, visando futuras aplicações em ensaios biológicos, um segundo protocolo foi estabelecido. O extrato enzimático obtido, como já descrito, foi submetido à crioprecipitação, precipitação ácida, fracionamento com sulfato de amônio (20-50% de saturação) e cromatografia de filtração gélica em Sephadex G-100. A α-galactosidase foi semi purificada em quatro etapas, com índice de purificação de 21,33 vezes e recuperação de 44% da atividade enzimática. Em conclusão, observamos que a adição de α -galactosidase ao extrato de soja hidrolisou uma fração significativa dos carboidratos não digeríveis, estaquiose e rafinose, podendo diminuir a flatulência causada por esses oligossacarídeos e assim aumentar o uso desta fonte protéica vegetal na alimentação humana e animal. Além disso, essa enzima apresenta características cinéticas compatíveis com as exigências para sua utilização em processos industriais, visando a diminuição nos teores dos oligossacarídeos de rafinose.Item Caracterização do processo de desdobramento da β -tripsina(Universidade Federal de Viçosa, 2002-08-05) Brumano, Maria Helena Nasser; Oliveira, Maria Goreti de Almeida; http://lattes.cnpq.br/3278484813785970O desdobramento no equilíbrio para a β-tripsina, induzido por desnaturação térmica, foi caracterizado termodinamicamente. O desdobramento foi acompanhado através de absorção no ultravioleta (UV) e espectroscopia de dicroísmo circular (DC) no UV próximo e distante. Além disso, experimentos utilizando a técnica de calorimetria diferencial de varredura (DSC) foram realizados. As curvas de transição térmica foram reversíveis mostrando um desdobramento altamente cooperativo, e os dados experimentais foram bem ajustados à um modelo de transição de dois-estados, para o desdobramento dessa proteína. O gráfico da fração desnaturada versus temperatura, calculado a partir das curvas de desnaturação térmica, em diferentes comprimentos de onda, mostra coincidência dessas curvas. Além disso, a razão entre a entalpia de desnaturação calorimétrica e a entalpia de van ́t Hoff, obtidas por DSC, é próxima à unidade, o que suporta o modelo de dois-estados. O espectro de DC da enzima nativa foi registrado na faixa espectral de 184 a 260 nm e utilizado para se estimar as porcentagens dos elementos da estrutura secundária, pelos métodos VARSCL e SELCON. A estimativa da estrutura secundária, em solução, correspondeu aos resultados de difração de raios-X. As mudanças na estrutura da β-tripsina, resultante de desnaturação por calor e por uréia foram monitoradas por meio de espectroscopia de DC no UV próximo e distante. A quantidade dos vários elementos de estrutura secundária foi estimada para essas mudanças espectrais, através dos espectros no UV distante, utilizando o método CCA (“Convex Constraint Algorithm”). De acordo com as estimativas, os estados desdobrados para essa proteína, ou seja, a 70 o C e em uréia 2,6 M, apresentaram quantidades consideráveis de estrutura secundária regular. Os espectros de fluorescência intrínsica dos resíduos de triptofano, registrados em diferentes concentrações de uréia, mostram a presença de um estado intermediário no equilíbrio, que apresenta grande afinidade pela sonda bis-ANS. Além disso, a ausência de contatos terciários e a presença de estrutura secundária para esse estado, verificados por meio de espectros de DC no UV próximo e distante, são consistentes com as características de um molten globule. As mudanças na atividade da β-tripsina foram observadas em concentrações de uréia nas quais não foram visualizadas nenhuma alteração espectroscópica da estrutura terciária da proteína. Os parâmetros cinéticos, k cat e K M , determinados na ausência e na presença de uréia, mostraram que o decréscimo na atividade da enzima, em baixas concentrações de uréia, foi provavelmente devido à formação do complexo EI, formado entre a β-tripsina e a uréia, um inibidor competitivo dessa enzima.Item Efeito hipolipidêmico e toxicológico do arroz fermentado por Monascus ruber , CCT 1236, em coelhos(Universidade Federal de Viçosa, 2002-08-05) Fonseca, Cristiane Sampaio; Queiroz, José Humberto de; http://lattes.cnpq.br/3313502292176385Produtos fermentados por fungos, em especial o “ang-kak” (arroz fermentado por fungos do gênero Monascus) são tradicionalmente usados na culinária asiática como corantes e condimentos. Estes fungos produzem uma substância denominada mevinolina, utilizada na redução da concentração do colesterol sérico. Essa substância inibe a enzima hidroximetilglutaril coenzima A redutase (HMG-CoA redutase), enzima chave na biossíntese do colesterol. Foi realizada a caracterização do arroz fermentado analisando as concentrações de proteínas, lipídios, carboidratos, cinzas e umidade. Posteriormente, foram realizados dois ensaios biológicos com o objetivo de avaliar os efeitos hipolipidêmicos e toxicológicos do arroz fermentado pelo fungo Monascus ruber. Utilizaram-se 36 coelhos machos da raça Nova Zelândia Branco, com hiperlipidemia induzida por colesterol 1% administrado na ração juntamente com o arroz fermentado que foi seco e triturado e adicionado nas concentrações de 1, 5 e 10%. Da análise do arroz fermentado verificou-se que houve um aumento nas concentrações de proteínas, lipídios e redução na concentração de carboidratos. O arroz fermentado na concentração de 10% foi mais eficaz no controle da hiperlipidemia, promovendo redução de colesterol total (37,14%), LDL-c (37,73%), VLDL-c (51,44%), triacilgliceróis (51,44%). O arroz fermentado a 10% promoveu aumento da lipoproteína HDL em 33,85% . O segundo ensaio foi realizado com a finalidade de avaliar a toxicologia aguda deste produto. Foram dosados as concentrações de creatinina, proteínas totais, albumina, bilirrubina total, bilirrubina direta, ácido úrico, fosfato, ferro, cloro, cálcio, e as atividades de gama glutamil-transferase (gama-GT), transaminase glutâmico- pirúvica (TGP), transaminase glutâmico-oxaloacética (TGO) e fosfatase alcalina no 1 o , 15 o , 30 o dias do experimento. No estudo toxicológico não foi observada variação significativa nos parâmetros bioquímicos analisados. No estudo histopatológico constatou-se que a adição de arroz fermentado na dieta dos animais não alterou a morfologia das células do coração. Quando adicionou-se o arroz fermentado juntamente com o colesterol, verificou-se que esse arroz impediu a formação de áreas extensas de lesões decorrentes da adição de colesterol. Quanto ao fígado, devido às características inerentes desse órgão em coelhos, o efeito da adição do arroz fermentado na dieta dos animais não levou a resultados conclusivos. O arroz fermentado por Monascus ruber se mostrou, promissor na modulação dietética de lipídios sanguíneos, embora estudos em outros modelos animais e humanos sejam necessários para resultados mais conclusivos.Item Caracterização bioquímica de proteases do intestino de Anticarsia gemmatalis envolvidas no mecanismo de interação planta-inseto(Universidade Federal de Viçosa, 2002-08-06) Xavier, Luciana Pereira; Oliveira, Maria Goreti de Almeida; http://lattes.cnpq.br/6207860145204571A identificação e caracterização de proteases de intestino médio de insetos são importantes para o desenvolvimento de cultivares resistentes ao ataque de insetos. Neste estudo, a atividade proteolítica em intestino médio de larvas de A. gemmatalis foi investigada. O extrato enzimático foi obtido após ciclos de congelamento e descongelamento dos intestinos e posterior centrifugação do homogenato a 100,000 g, e o sobrenadante resultante (Fração I) foi utilizado como fonte de proteína solúvel. Como parte de nossos estudos, envolvendo a identificação de proteases do intestino médio de larvas de of A. gemmatalis, a presença de enzimas ligadas a membrana foi avaliada. Para este propósito, o precipitado do homogenato de intestino médio centrifugado a 100,000 g. foi ressuspendido em tampão com Triton X-100, centrifugado como anteriormente e o sobrenadante (Fração II) usado como fonte de proteases ligadas à membrana. A Fração I foi capaz de hidrolisar a caseína, e o substratos sintéticos L -BApNA e TAME. Usando L - BApNA como substrato, a atividade da Fração I foi investigada na presença de vários inibidores de proteases. Assim, EDTA, PMSF, TLCK, benzamidina e aprotinina, foram todos capazes de inibir a atividade da Fração I, com maior inibição observada com TLCK e benzamidina. De acordo com este resultados, conclui-se que o intestino médio de larvas de A. gemmatalis possui uma serino protease trpsina-like. Com o propósito de caracterizar melhor a atividade tripsina-like, foi determinada a atividade ótima para a Fração I. O pH ótimo foi de 8.5 e à temperatura ótima foi a 35 o C, sobre L -BApNA. O pH ótimo e temperatura foi de 8.0 e 30 o C, sobre TAME. O efeito de cálcio na atividade da Fração I foi investigado usando L -BApNA como substrato. A atividade máxima foi obtida na concentração de 20 mM de cálcio. Valores de K Mapp para L -BApNA e TAME foram de 0.32mM e 52.5μM, respectivamente. A Fração II foi capaz de hidrolisar a caseína, e os substratos sintéticos, L -BApNA e TAME. O efeito de vários inibidores de proteases também foi avaliado, usando L -BApNA como substrato. EDTA, PMSF, TLCK, benzamidina e aprotinina foram capazes de inibir a atividade da Fração II, com TLCK e benzamidina exibindo forte inibição. Estes resultados mostram que o intestino médio de larvas de A. gemmatalis possui proteases tripsin-like ligadas a membrana. Esta atividade tripsina-like foi melhor caracterizada. O pH ótimo para a Fração II usando L -BApNA e TAME foi 8.5 e 8.0, respectivamente. A atividade ótima exibida foi a 50 o C para ambos substratos, L-BApNA e TAME. Na concentração de 20 mM de cálcio, a Fração II mostrou um aumento na atividade sobre o L -BApNA. Os valores de K Mapp para L -BApNA e TAME foram de 0.23mM e 95.4 μM, respectivamente.Item Natureza recombinante e propriedades patogênicas do DNA-A do begomovírus ToCMV-[MG-Bt1](Universidade Federal de Viçosa, 2003-02-26) Luz, Dirce Ferreira; Almeida, Márcia Rogéria de; http://lattes.cnpq.br/7597740439389337Espécies do gênero Begomovirus (família Geminiviridae) encontradas no hemisfério ocidental tem tipicamente um genoma bissegmentado que consiste em dois componentes genômicos de 2,6 Kb, denominados DNA-A e DNA-B. Atualmente, a grande diversidade de begomovírus patogênicos identificados tem sido explicada pela alta frequência de eventos de recombinação. Relatos adicionais também tem evidenciado a importância dos eventos de recombinação inter-espécies na evolução dos begomovírus e na sua emergência como patógenos relevantes na agricultura. Utilizando-se um programa computacional para detecção de recombinação foram observados eventos de recombinação estatisticamente significantes entre as sequências completas do componente DNA-A de begomovíus que infectam tomateiros, recentemente identificados no Brasil. As progênies recombinantes exibiram diferentes propriedades biológicas e propriedades patológicas aumentadas quando comparadas com os seus prováveis predecessores. O DNA-A de Tomato chlolorotic mottle virus ToCMV-[MG-Bt1], de Minas Gerais, da região de Betim, identificado e clonado por nosso grupo, possui um genoma híbrido no qual o módulo compatível de replicação (AC1 e a origem de replicação) foi provavelmente doado por ToCMV-[BA-Se1] e as sequências remanescentes parecem ter sido originadas de Tomato rugose mosaic virus (ToRMV). Apesar do alto grau de conservação de sequência com os seus predecessores, ToCMV-[MG-Bt1] difere significantemente nas suas propriedades biológicas. De fato, ToCMV-[MG-Bt1] infectou seu hospedeiro natural Lycopersicon esculentum, induziu sintomas atenuados e acumulou DNA viral nas folhas apicais na ausência de um DNA-B cognato. Foi caracterizada a patogenicidade deste DNA-A clonado e infeccioso através de uma gama de hospedeiros, e a efetividade foi avaliada via inclusão de um DNA-B compatível em ensaios de infectividade. O DNA-A de ToCMV-[MG-Bt1] sozinho é capaz de infectar sistematicamente e causar sintomas nos hospedeiros permissíveis Nicotiana benthamiana, Chenopodium amaranticolor e Chenopodium quinoa. Ele move-se sistematicamente em Datura stramonium, mas causa uma infecção assintomática. O acúmulo do DNA viral nas plantas infectadas foi confirmado por PCR. A inclusão de um componente B compatível nos ensaios de infectividade não alterou a sintomatologia das doenças mediadas pelo ToCMV-[MG- Bt1]-A, também não aumentou o nível do DNA-A nos hospedeiros permissíveis. Assim, os resultados deste trabalho forneceram evidências adicionais sobre os eventos de recombinação inter-espécies que podem desempenhar um papel significativo na diversidade dos geminivírus e na sua emergência como patógenos importantes na agricultura.Item Purificação, caracterização bioquímica e atividade antimicrobiana de peptídeos de semente de soja (Glycine max [L.] Merryll)(Universidade Federal de Viçosa, 2003-03-27) Nascimento, Danielle Gomes; Pereira, Maria Cristina Baracat; http://lattes.cnpq.br/7342098342545688As doenças infecciosas estão entre as principais causas de morte da população humana. Esse fato é causado, em grande parte, pelo surgimento de microrganismos multi-resistentes aos antibióticos. Portanto, apesar da disponibilidade de um grande número de antibióticos de última geração, torna-se ainda fundamental buscar compostos que possam atuar como novas drogas a serem utilizadas no combate as doenças infecciosas. Em plantas, a atividade antimicrobiana pode ser demonstrada por vários tipos de moléculas, como as proteínas relacionadas com a patogenicidade, os componentes orgânicos das plantas, as famílias de peptídeos antimicrobianos e as espécies ativas de oxigênio e nitrogênio. Atualmente, peptídeos antimicrobianos de origem vegetal estão sendo utilizados como modelos para o desenho de novas drogas com aplicação nas áreas agrícolas e de saúde. Deste modo, nosso trabalho objetivou a determinação da metodologia mais eficaz para a purificação dos peptídeos catiônicos, presentes em sementes maduras de soja, com atividade antimicrobiana ou outras, e a caracterização bioquímica destes peptídeos visando à obtenção de informações de importância para a elucidação de suas funções biológicas. Os peptídeos de semente madura de soja foram extraídos, na proporção de 1:5 (gramas semente : mL tampão), em tampão fosfato de sódio 25 mM, pH 7,4, contendo KCl 100 mM, EDTA 2 mM, PVP 1,5% (p/v), tiouréia 2 mM, PMSF 1 mM e benzamidina 1 mM por homogeneização do extrato durante 2 h a 4 °C, em banho de gelo. O extrato obtido foi centrifugado a 20.300 x g a 4 °C e o sobrenadante obtido após o final da extração foi fracionado com sulfato de amônio sólido 35% sat. e centrifugado sob as mesmas condições. O sobrenadante foi aquecido a 80°C por 15 min e novamente centrifugado sob as mesmas condições. Após a diálise do extrato em membrana de exclusão de 1.000 Da, foram realizadas as cromatografias de troca aniônica, em coluna DEAE- Sepharose equilibrada com tampão Tris-HCl 50 mM, pH 8,0; a de exclusão molecular, em coluna Superdex Peptide equilibrada com tampão Tris-HCl 50 mM, pH 8,0, contendo 150 mM de NaCl; e a de fase reversa, em coluna C 18 equilibrada com acetonitrila 80% e TFA 0,1%, para obtenção dos peptídeos catiônicos purificados. A análise em espectrômetro de massa das frações eluídas do HPLC indicou a presença de compostos de massas moleculares menores do que 500 Da, 678,61 Da e 700,60 Da, a presença de peptídeos com massas moleculares de 5.809,11 Da, 8.526,97 Da e 14.113,18 Da. A seqüência de aminoácidos do peptídeo de 5.809,11 Da foi determinada e mostrou alta homologia com as cadeias B da pró-insulina humana e de vários outros organismos, da insulina bovina e da insulina de feijão-de-porco (Canavalia ensiformes). Os compostos presentes em dois pools eluídos da cromatografia de exclusão molecular, pool 2 e pool 3, inibiram o crescimento da bactéria Gram-negativa Ralstonia solanacearum, enquanto que, para a bactéria Gram-positiva Clavibacter michiganensis, somente o pool 3 exerceu alguma ação, mas com a inibição do crescimento muito menor do que a obtida para a Ralstonia solanacearum. Assim, estes compostos apresentam potencial antimicrobiano a ser explorado na indústria agrícola.Item Desenvolvimento de técnicas biomoleculares para diagnóstico de circovírus suíno(Universidade Federal de Viçosa, 2003-04-04) Monnerat, Filipe Silva; Almeida, Márcia Rogéria de; http://lattes.cnpq.br/9048502123818522O circovírus suíno (PCV) é um agente amplamente distribuído na Europa, América do Norte e sul da Ásia. O PCV é um pequeno vírus de cadeia simples de DNA (17 nm) que foi reconhecido, a partir da década de 90, como um patógeno de suíno. Dois tipos de PCV tem sido caracterizados e designados PCV tipo 1 (PCV1) e PCV tipo 2 (PCV2). O PCV1 foi primeiramente isolado em 1974 como um contaminante persistente da linhagem de células PK-15 de rim de suíno (ATCC CCL 31) e a cepa de PCV isolada de células PK-15 tem sido bem caracterizada. O PCV1 é considerado como um vírus não patogênico, enquanto que a infecção de um suíno pelo PCV2 é normalmente associada ao desenvolvimento de Síndrome Multissistêmica Pós-Desmame (PMWS), em animais de 5 a 12 semanas de idade, e ao tremor congênito (CT), que acomete animais no período neonatal. A PMWS é uma nova doença emergente de suínos, caracterizada clinicamente por dispnéia progressiva, aumento dos nódulos linfáticos e patologicamente caracterizada por uma ampla extensão de lesões inflamatórias. Recentemente, pesquisadores da EMBRAPA iniciaram um estudo da PMWS em leitões, mas no Brasil a presença do PCV ainda não é reconhecida oficialmente. O objetivo desse trabalho foi (1) padronizar técnicas de diagnóstico para o genoma e antígeno do PCV, assim como anticorpos contra o agente; (2) avaliar a susceptibilidade de diferentes linhagens celulares ao PCV; (3) diagnosticar a infecção do PCV em suínos da Zona da Mata de Minas Gerais; (4) isolar o PCV de amostras positivas. O PCV, proveniente de tecidos de animais normais e com diagnóstico de CT, foi isolado em células SK6 e analisadas por PCR. O padrão de bandas foi o mesmo encontrado em células PK15 contaminadas com PCV2, gentilmente cedidas pela EMBRAPA. Os oligos usados diferenciavam o PCV1 do PCV2. Todos os leitões de maternidade testados por PCR foram positivos para o PCV2. Porém, em 59 animais de abate testados por PCR não foi observada a presença do PCV. No teste de susceptibilidade as células PK15, SK6, VERO e MDCK foram susceptíveis ao PCV, mas somente as PK-15 estavam persistentemente infectadas. No ensaio de imunofluorescência indireta, foi utilizado um conjugado anti-IgG suína previamente padronizado e anticorpos contra PCV foram identificados em soros de 24 em 44 animais de abate testados e nenhum anticorpo foi encontrado nos animais com diagnóstico de CT positivos para PCV2 por PCR. Com esses resultados podemos concluir que os 24 suínos de abate soropositivos entraram em contato com o agente e desenvolveram a infecção em alguma fase durante o estagio de produção. A ausência de soropositivos entre os leitões recém nascidos, aliada a presença de infecção, pode ser explicada pela incapacidade de produção de anticorpos por esses animais neste estágio de desenvolvimento. Estudos adicionais da epidemiologia e da imunologia de infecções pelo PCV são necessários para o melhor entendimento e efetivo controle das doenças associadas a esse vírus.Item Herdabilidades e correlações entre concentrações de proteína em soja avaliadas por diferentes metodologias(Universidade Federal de Viçosa, 2003-07-31) Teixeira, Arlindo Inês; Moreira, Maurílio Alves; http://lattes.cnpq.br/2334788531499774Os principais objetivos deste trabalho foram estimar a herdabilidade no sentido amplo e restrito da concentração de proteína em soja, avaliada pelas metodologias do ácido bicinconínico (BCA) e pelo método de Kjeldahl, estimar a herdabilidade da concentração das proteínas de reserva da soja (frações 7S e 11S), avaliadas por eletroforese em gel de poliacrilamida em condição desnaturante (SDS- PAGE) seguida de densitometria e estimar as correlações entre as concentrações de proteína obtidas pelas diferentes metodologias. Para isso, cortou-se com o auxílio de uma lâmina uma parte do cotilédone das sementes originadas da população F 2 derivada do cruzamento entre uma linhagem de alto teor protéico com a variedade comercial Elite, e dos dois progenitores, tomando-se o cuidado para não danificar o embrião, o que prejudicaria o poder germinativo da semente. Esta parte da semente foi utilizada nas análises para determinação da concentração de proteínas totais pelos métodos de Kjeldahl, adaptado para pequenas quantidades de semente (15 mg), e do Ácido Bicinconínico; e também na análise da concentração das proteínas de reserva por SDS-PAGE/densitometria. A outra parte da semente foi cultivada em casa de vegetação, obtendo-se por auto-fecundação a população F 3 . Após a colheita, 10 sementes de cada planta obtida foram moídas e utilizadas na análise da concentração de proteínas totais pelo método de Kjeldahl e na análise da concentração das subunidades das proteínas de reserva por SDS-PAGE/densitometria. A análise dos resultados permitiu concluir que a maior estimativa de herdabilidade no sentido amplo para teor de proteínas na geração F 2 foi obtida pelo método de Kjeldahl (56,2%). Para as concentrações das proteínas de reserva estes valores foram de 62,1% para a concentração de 7S, 43,4% para a concentração de 11S e 50,5% para a soma da concentração das duas frações, indicando que a quantificação da concentração das proteínas de reserva por SDS- PAGE/densitometria pode ser útil em programas de melhoramento para qualidade protéica em soja. As herdabilidades no sentido restrito apresentaram baixos valores para todas metodologias, variando de 1,87 a 7,14%. Os efeitos do ambiente e da interação genótipo x ambiente sobre o teor de proteína das populações foram significativos. Os coeficientes de correlação de Spearman entre as concentrações das proteínas de reserva 7S e 11S com a concentração de proteínas totais determinada pelo método de Kjeldahl e entre as concentrações de 7S e 11S foram positivos e significativos nas duas gerações, F 2 e F 3 . Os coeficientes de correlação de Pearson e de Spearman entre as concentrações de proteína na população F 2 determinadas pelos métodos BCA e Kjeldahl foi de 0,131 e 0,385 respectivamente, indicando baixa correlação e baixa coincidência entre os métodos. Os coeficientes de correlação de Spearman entre as concentrações das proteínas 7S e 11S da população F 2 com as concentrações destas proteínas na população F 3 foram pequenos e negativos. O coeficiente de correlação de Spearman entre as concentrações de proteínas totais na população F 2 e na população F 3 determinada pelo método de Kjeldahl foi de 0,16, indicando também que aqueles indivíduos que apresentaram altas concentrações de proteína em F 2 não geraram indivíduos com o mesmo desempenho em F 3 , indicando que a seleção precoce não seria eficiente no cruzamento estudado.Item Tolerância ao estresse hídrico mediada pela proteína BiP de soja em plantas transgênicas de tabaco(Universidade Federal de Viçosa, 2003-07-31) Vaez, Juliana Rocha; Fontes, Elizabeth Pacheco Batista; http://lattes.cnpq.br/7534198613724657A proteína de ligação (BiP) é um importante componente de resposta ao estresse no retículo endoplasmático (RE). Tem sido demonstrado que níveis elevados de BiP em tabaco transgênico de linhagens senso conferem tolerância à tunicamicina, um inibidor de glicosilação, durante a germinação e tolerância ao déficit hídrico durante o crescimento das plantas. Para avaliar a função protetora de BiP contra estresses abióticos, linhagens homozigotas T3 expressando o gene BiP da soja na orientação senso e anti-senso, foram obtidas através de análises de segregação do loco do T-DNA das gerações T2 e T3. Sob déficit hídrico progressivo, níveis de BiP em folhas de linhagens transgênicas com a orientação senso estão correlacionados com a manutenção da turgidez de broto e do conteúdo de água, independentemente do grau de intensidade do estresse. Contudo, o efeito protetor da superexpressão de BiP contra estresse hídrico não é perdido na expressão do cDNA de BiP da geração T4 das linhagens homozigotas anti-senso. A suscetibilidade das linhagens anti-senso ao déficit hídrico foi similar aos controles, plantas não-transformadas. Esse resultado pode indicar que ocorreu seleção natural dos transformantes com baixa expressão do gene anti- senso nas gerações subseqüentes. O caráter essencial dos genes BiP pode levar a uma pressão seletiva para o silenciamento do gene anti-senso. A função de BiP na tolerância contra estresses do RE foi investigada na geração T3 de plantas transgênicas senso e anti-senso de N. tabacum. Aparentemente, a superexpressão constitutiva de BiP não atenuou a letalidade ocasionada pela inibição da glicosilação pela tunicamicina nas concentrações de 0,6 a 1,0 μg/mL. Nessas condições, a tunicamicina inibe a indução de brotos mais eficientemente em plantas superexpressando BiP do que nas selvagens. Análises de immunoblottings detectaram aumento no nível de BiP nas concentrações de tunicamicina de 0,8 e 1,0 μg/mL. A indução de BiP foi coordenada com o acúmulo de um produto de degradação de 25-28 kDA, indicando a existência de uma co-regulação entre a via de resposta a proteínas mal dobradas (UPR) e o sistema de degradação de proteínas associadas ao RE em células de plantas. O aumento no nível de BiP em discos foliares transgênicos senso foi similar ao observado em controles após o tratamento com tunicamicina. Entretanto, o tratamento de discos foliares senso não promoveu acúmulo adicional de BiP nem do produto de degradação de 25-28 kDa. Tais resultados evidenciam que o nível de BiP pode atuar como sensor para ativação de resposta a estresses em plantas. Portanto, elevados níveis de BiP em células de plantas inibem a ativação da via UPR e podem evitar a ativação do sistema ERAD.Item Hidrólise de oligossacarídeos de rafinose, presentes em produtos de soja, por α -galactosidases(Universidade Federal de Viçosa, 2003-07-31) Callegari, Carina Marin; Rezende, Sebastião Tavares de; http://lattes.cnpq.br/8476181374339592A ingestão de grãos de leguminosas, como a soja e derivados, resulta no aparecimento de sintomas desagradáveis, destacando-se a flatulência. Flatulência é resultante do metabolismo anaeróbico de α-1,6-galactosídeos de rafinose (RO: oligossacarídeos de rafinose) presentes nos grãos das leguminosas em geral. A remoção desses açúcares poderia aumentar o consumo de alimentos derivados de soja. A hidrólise enzimática dos RO, catalisada por α-galactosidases, parece ser o tratamento mais promissor para a redução do conteúdo de RO em produtos derivados de soja. O objetivo deste trabalho foi verificar a eficiência de α-galactosidases de várias fontes para hidrolisar os RO presentes no extrato desengordurado de soja e nos produtos melaço leve e pesado. Foram testadas α-galactosidase de sementes germinadas de soja e de Tachigali multijuga , α-galactosidases de Aspergillus terreus e de Penicillium griseoroseum. O processo de purificação do extrato enzimático, obtido de sementes de soja var. Monarca, embebidas por 60 h, consistiu das etapas de crioprecipitação, precipitação ácida, fracionamento com sulfato de amônio e cromatografias de filtração em gel e de troca iônica, resultando numa preparação contendo atividade de α-galactosidase. A enzima foi purificada 19,74 vezes, com rendimento de 36,64%. Atividade máxima de α- galactosidase foi detectada em pH 5,0 a 50 °C. Cerca de 90% da atividade enzimática original foi mantida, após pré-incubação por 4 h a 40 °C. Os valores de K M ap para ρNPGal, melibiose e rafinose foram de 0,47 mM, 1,46 mM e 3,43 mM, respectivamente. A enzima hidrolisou com maior intensidade o ρNPGal, seguido por rafinose, estaquiose e melibiose. Galactose, SDS, CuSO 4 , rafinose, estaquiose e melibiose atuaram como inibidores da atividade de α-galactosidase. Os resultados dos tratamentos do extrato desengordurado de soja com a preparação enzimática contendo atividade de α-galactosidase, mostraram redução de 100% de rafinose e 53% de estaquiose, após incubação por 8 h, a 40 °C. Quando o extrato desengordurado de soja foi tratado com a α-galactosidase de Tachigali multijuga, a S1 de A. terreus e a de P. griseoroseum, constatou-se redução no teor de rafinose de 72%, 100% e 66%, e no teor de estaquiose de 49%, 100% e 100%, respectivamente, após incubação por 8 h, a 40 °C. A redução no teor de RO nos produtos melaço leve e pesado de soja, tratados com a preparação enzimática contendo atividade de α-galactosidase, foi de 100% para rafinose e 58% para estaquiose, após incubação por 8 h, a 40 °C, para ambos os produtos. Conclui-se que as α-galactosidases testadas hidrolisaram substancialmente os carboidratos não- digeríveis, rafinose e estaquiose, do extrato desengordurado de soja e dos produtos melaço leve e pesado de soja, indicando uma possível utilização destas enzimas em processos industriais, visando a diminuição dos RO e o aumento do uso da soja como fonte protéica vegetal na alimentação humana e animal.Item Efeito do armazenamento sobre a digestibilidade e qualidade protéica de cultivares de feijão (Phaseolus vulgaris L.)(Universidade Federal de Viçosa, 2003-10-16) Cruz, Geralda Aldina Dias Rodrigues; Oliveira, Maria Goreti de Almeida; http://lattes.cnpq.br/2804290069100939No Brasil, o feijão é considerado um dos cultivos de maior importância na produção de alimentos básicos para a população. Como o país tem grandes áreas que podem ser aproveitadas para o plantio dessa cultura, pesquisas tornam-se necessárias a fim de preservar a qualidade do grão após a colheita. A qualidade do feijão está relacionada com produção por unidade de área, características de aceitabilidade pelo consumidor e valor nutritivo. Dessa forma, a melhoria da qualidade do feijão será obtida pela interação entre melhoramento agronômico, ciência e tecnologia de alimentos e nutrição. Assim, com o objetivo de avaliar a qualidade da proteína dos cultivares Aporé, Aruã, A774, Carioca, Diamante Negro, Ouro Branco, Ouro Negro, Pérola, RAO 33, Rudá e Vermelho Coimbra, armazenados por 30 dias e fornecidos pela EMBRAPA – Arroz e Feijão, localizada em Goiânia, GO, procedeu-se à avaliação biológica em ratos machos recém-desmamados e determinou-se a digestibilidade verdadeira e aparente, Protein Efficciency Ratio (PER), Net Protein Ratio (NPR) e Net Protein Utilization (NPU). Foram também analisados quatro métodos para ensaio de digestibilidade in vitro, utilizando-se um sistema multienzimático com as enzimas tripsina, quimotripsina e pancreatina. A equação de regressão obtida dos valores in vivo e in vitro foi usada para correlacionar os estudos in vitro com os ensaios in vivo e, dessa forma, predizer a digestibilidade. Utilizaram-se as digestibilidades verdadeira e aparente de todos os feijões de todos os grupos e separadamente do grupo Carioca, obtidos recém-colhidos e armazenados durante 30 dias, para estabelecer-se o melhor coeficiente de correlação das metodologias analisadas. Os resultados obtidos indicaram que as digestibilidades verdadeira e aparente variaram de 77,58 e 76,77% para a variedade Pérola a 87,46 e 86,65% para a variedade Ouro Branco, respectivamente, as quais, como todas as outras variedades, diferiram significativamente do padrão (caseína). Na análise de PER, a variedade Ouro Branco foi a que obteve melhor desempenho nutricional, apresentando valores de PER e RPER significativamente maiores (2,40 e 61,24%), enquanto a variedade Vermelho Coimbra foi a que exibiu menor valor (1,67 e 42,60%), diferindo significativamente das outras variedades analisadas e do valor obtido para caseína. Os valores de NPR e RNPR foram significativamente menores que os encontrados na caseína e situaram-se entre 2,54 e 57,33% na variedade Vermelho Coimbra e entre 3,55 e 80,13% na ‘Ouro Branco’. Os resultados de NPU e RNPU ficaram entre 38,36 e 52,47 e 56,64 e 77,69%. Os valores encontrados nas variedades de feijões armazenadas foram, na sua totalidade, superiores aos da literatura, o que demonstra que, apesar do tempo de armazenamento, essas variedades tiveram aproveitamento nutricional melhor que outras. O método de avaliação da digestibilidade in vitro que obteve maior R 2 e coeficiente de correlação com os ensaios in vivo, utilizando a combinação dos valores das digestibilidades aparente e verdadeira de todas as variedades armazenadas de feijões recém-colhidos, foi o desenvolvido neste trabalho, que apresentou valores que variaram de 0,75 a 0,83 para o R 2 e de 0,87 a 0,91 para o coeficiente de correlação. A diferença entre os valores de digestibilidade in vivo e in vitro, calculados a partir desse método, foi menor nos feijões recém-colhidos e variou de –2,95 a +3,98 e de –2,97 a +2,61, com relação às digestibilidades verdadeira e aparente, respectivamente. Nos feijões armazenados, a diferença foi maior, variando de –9,65 a +1,09 para a digestibilidade verdadeira e de –7,75 a +3,12 para a aparente. Para a combinação dos valores de digestibilidades verdadeira e aparente das variedades do grupo Carioca, o melhor método também foi o desenvolvido neste trabalho para os feijões recém-colhidos. Os valores de R 2 e coeficiente de correlação apresentados foram de 0,90 e 0,95, tanto para a digestibilidade verdadeira quanto para a aparente. Nos caso dos feijões armazenados, os melhores foram os métodos descritos por HSU et al. (1977) para a digestibilidade verdadeira e por SATERLEE et al. (1979) para a digestibilidade aparente. Os valores de R 2 e o coeficiente de correlação apresentados foram 0,90 e 0,95 para a digestibilidade verdadeira e 0,83 e 0,91 para a aparente, respectivamente. As diferenças entre os valores de digestibilidade in vivo e in vitro, calculados a partir desses métodos, para o grupo Carioca, também foram menores nos feijões recém-colhidos e variaram de –2,77 a +4,15 e de –2,78 a +1,83 para as digestibilidades verdadeira e aparente, respectivamente. Nos feijões armazenados, a diferença foi maior, variando de – 6,68 a +2,59 para a digestibilidade verdadeira e de –6,30 a +3,10 para a aparente. Esses resultados evidenciam que o tempo de armazenamento interfere de forma negativa, aumentando a diferença entre os valores absolutos de digestibilidade in vivo e in vitro e diminuindo a correlação entre os estudos.Item Resposta bioquímica da lagarta da soja ao inibidor de protease benzamidina e seus efeitos no desenvolvimento pós-embrionário(Universidade Federal de Viçosa, 2004-02-11) Pilon, Anderson Martins; Oliveira, Maria Goreti de Almeida; http://lattes.cnpq.br/3029855503851279Dos seres vivos existentes, 72% são insetos, sendo que 50% destes são fitófagos. Na coevolução entre plantas e insetos, as plantas desenvolveram mecanismos de defesa contra o ataque de insetos. Dentre estes mecanismos destaca-se a produção de inibidores de protease. É postulado que, quando uma planta é atacada ou ferida, ela propicia um aumento nos níveis de inibidores de proteases na região ferida (resposta local) e ou por toda a planta (resposta sistêmica). Nesta interação inseto-planta, os insetos podem desenvolver mecanismos de defesa contra os inibidores de proteases produzidos pela planta. Esta possibilidade demanda um conhecimento mais elaborado do comportamento das enzimas proteolíticas do intestino médio dos insetos, a partir da ingestão crônica de inibidores de protease no momento do ataque à planta. Plantas de soja atacadas por larvas de Anticarsia gemmatalis (Hübner) (Lepidoptera: Noctuidae) induzem, através da via das lipoxigenases, o aumento na síntese de inibidores de proteases, como uma forma de defesa ao ataque do inseto (FORTUNATO, 2001). Este inseto apresenta proteases tripsinas-like como enzimas digestivas (XAVIER, 2002). Tomando conhecimento destas informações e por ser a soja uma importante cultura para a economia brasileira, buscamos realizar a caracterização bioquímica e fisiológica do efeito do inibidor de tripsina benzamidina na digestibilidade protéica, crescimento e desenvolvimento de Anticarsia gemmatalis. Neste sentido, o presente trabalho baseou-se na determinação da digestibilidade e os efeitos no crescimento e desenvolvimento de larvas de A. gemmatalis, assim como a avaliação da atividade das proteases digestivas presentes no intestino médio da lagarta, quando alimentadas com o inibidor de tripsina benzamidina nas concentrações 0; 0,25; 0,50 e 0,75 (% p/p de dieta artificial). Verificamos, através do teste de Tukey (p < 0,05), que a adição de benzamidina alterou significativamente a digestibilidade do alimento proteico. Tal alteração está correlacionada com impactos negativos ocasionados na fase larval desse inseto, tais como aumento do ciclo larval, diminuição de ganho de peso e aumento da mortalidade. Verificamos que tanto a atividade proteolítica quanto a atividade amidásica apresentaram maiores índices em lagartas de 5o instar. Observamos também que a presença do inibidor alterou os perfis de atividades, sugerindo que os insetos, após a ingestão alta de inibidores de proteases, podem apresentar respostas de defesa através da hiperprodução de proteases sensíveis à benzamidina e/ou síntese de proteases insensíveis ao inibidor. Portanto, estes dados sugerem que a utilização de inibidores de protease possa ser uma estratégia promissora no controle de Anticarsia gemmatalis na cultura da soja.Item Mapeamento de locos associados ao conteúdo de proteínas de reserva em soja(Universidade Federal de Viçosa, 2004-03-24) Soares, Taís Cristina Bastos; Moreira, Maurilio Alves; http://lattes.cnpq.br/6580031598802359Uma população de 118 RILs (linhagens recombinantes endogâmicas) foi obtida por meio do cruzamento entre o acesso BARC-8 (com alto teor de proteína) e a variedade brasileira Garimpo (com teor de proteína normal). Na geração F 9 foram abertas linhas, que constituíram o material genético utilizado neste trabalho. Noventa e cinco dessas RILs, cultivadas em dois ambientes distintos: Viçosa, MG e São Gotardo, MG, foram analisadas para as seguintes características: teor de proteína total em sementes de soja, teor das proteínas de reserva 11S e 7S e de suas respectivas subunidades, e da relação proteína total menos proteínas de reserva (PT-(11S+7S)). Quase todas estas características apresentaram uma distribuição aproximadamente normal (P<0,01), com exceção de proteína total em Viçosa. As herdabilidades das características avaliadas foram altas nos dois locais, entretanto, na análise conjunta, as herdabilidades foram menores devido ao efeito da interação genótipo X ambiente. Amostras do DNA das 118 RILs foram amplificadas com primers microssatélites, RAPD e AFLP. Análise de associação de marcas simples, regressão múltipla e mapeamento por intervalo composto foram utilizados para detectar e mapear as regiões genômicas associadas com estas características. Foram encontrados QTLs associados ao conteúdo de proteína total (GL I, que explica 14,74% da variação desta característica), ao conteúdo da subunidade α (GL G e GL C2, que explicam em conjunto 28,83% da variação desta característica), ao conteúdo da subunidade β (GL G e dois no grupo K, que explicam em conjunto 32,62% da variação desta característica), ao conteúdo de PT-(11S+7S) (GL D1b, que explica 13,71% da variação desta característica) e ao conteúdo de 7S (GL G e GL E) que explicam em conjunto 21,86% da variação desta característica no experimento de Viçosa. No experimento de São Gotardo, foram encontrados QTLs associados ao conteúdo de proteína total (GL 3 e I, que explicam em conjunto 11,42% da variação desta característica), ao conteúdo da subunidade α’ (GL A2, que explica 10,64% da variação desta característica), ao conteúdo das subunidades ácidas (GL 3, que explica 12,06% da variação desta característica), ao conteúdo de PT-(11S+7S) (GL I, que explica 11,34% da variação desta característica) e ao conteúdo de 11S (dois QTLS em diferentes fragmentos do GL K) que explicam em conjunto 20,88% da variação desta característica. Os marcadores associados ao teor de proteína foram diferentes de um local para outro, o que indica interação entre o genótipo e o ambiente. O grupo de ligação I foi associado a QTLs para proteína total em Viçosa e em São Gotardo. Este fato sugere que os locos associados presentes neste grupo de ligação contêm regiões com genes que são expressos em diferentes ambientes.Item Alfa-amilase em frangos de corte: efeitos do balanço eletrolítico e do nível protéico da dieta(Universidade Federal de Viçosa, 2004-07-16) Monteiro, Marcela Piedade; Moraes, George Henrique Kling de; http://lattes.cnpq.br/7257201572851464O desenvolvimento do aparelho digestório, a produção de enzimas digestivas e o balanço eletrolítico da dieta são importantes fatores para o crescimento animal. Assim, objetivou-se o estudo dos efeitos dos níveis de 20 e 23% de proteína bruta (PB) combinados com zero, 50, 100, 150, 200, 250 mEq/kg de balanço eletrolítico (BE) sobre a atividade da α-amilase pancreática em frangos de corte de 1 a 21 dias. O experimento foi conduzido com pintos de um dia, machos, da linhagem comercial Ross, por 21 dias, num delineamento inteiramente casualizado. As dietas experimentais continham 20% e 23% de PB, suplementadas com sais para obter os BE de zero, 50, 100, 150, 200 e 250 mEq/kg. Dietas e água foram fornecidos ad libitum. Aos um, 7, 14 e 21 dias, três aves de cada tratamento foram sacrificadas por deslocamento cervical e tiveram o pâncreas removido, homogeneizado, congelado em nitrogênio líquido e liofilizado. Uma alíquota de cada amostra foi solubilizada em água deionizada e centrifugada a 7500 x g por 3 minutos a 4 0 C. A atividade da α-amilase pancreática foi determinada no sobrenadante com kit da In Vitro Diagnóstica. A concentração de proteína do homogenato foi determinada pelo método de WARBURG e CHRISTIAN (1941). Aves alimentadas com 20% de PB apresentaram atividades específicas (U/mg de proteína) maiores do que aquelas que receberam 23% de PB aos 7 e 21 dias de idade. Aves alimentadas com níveis de BE de 100 a 200 mEq/kg e 23% de PB tiveram maiores atividades do que aquelas alimentadas com 20% de PB aos 14 dias. Observou-se tendência a aumento da atividade específica dos 7 aos 14 dias e redução dos 14 aos 21 dias de idade. Sendo assim, para maior atividade específica de α-amilase pancreática, propõe-se dietas com 20% de PB e 200 mEq/kg de BE na fase pré-inicial, dietas com 20% de PB e 135 a 250 mEq/kg de BE dos 8 aos 21 dias de idade.Item Correlação entre as concentrações de BiP e de proteínas de reserva em sementes de soja(Universidade Federal de Viçosa, 2004-07-30) Valente, Maria Anete Santana; Fontes, Elizabeth Pacheco Batista; http://lattes.cnpq.br/7809094025770798O dobramento de proteínas secretórias no lúmen do retículo endoplasmático é altamente facilitado por chaperones moleculares. A proteína BiP é um dos chaperones mais bem caracterizados residentes do RE. BiP tem demonstrado ser um modulador multifuncional de vários processos que ocorrem no retículo endoplasmático. Essa proteína auxilia no dobramento e enovelamento das cadeias polipeptídicas nascentes e exerce papel no controle de qualidade do RE, reconhecendo e direcionando proteínas incorretamente dobradas para degradação. Também funciona como um sensor da via de resposta a proteínas incorretamente enovelada (UPR), regulando indiretamente a atividade da cinase eIF-2 e a sua própria expressão. As proteínas de reserva são sintetizadas em ribossomos associados à membrana do retículo endoplasmático, sendo co-traducionalmente translocadas para o lúmen do RE, onde podem permanecer associadas em corpos protéicos ou ser transportadas, via complexo de Golgi, para vacúolos de proteínas de reserva. Evidências na literatura indicam que BiP associa-se com proteínas de reserva in vitro, e seu acúmulo nas sementes está coordenado com a síntese de proteínas de reserva. Nesta investigação, foram analisados o nível de BiP nos diferentes estádios de desenvolvimento de sementes de soja e a correlação entre as concentrações de BiP e de proteínas de reserva de sementes. Para isso, utilizaram-se sementes de soja das variedades CAC-1 e CC3 com diferentes teores de proteína, determinados pelo método Kjeldahl. BiP acumulou-se predominantemente nos estádios iniciais de desenvolvimento das sementes, coincidindo com a síntese ativa de proteínas de reserva. O acúmulo temporal de BiP foi significativamente superior nas sementes CC3 que apresentam maior teor protéico. A capacidade de BiP associar-se a proteínas de reserva foi funcionalmente avaliada por meio do sistema duplo híbrido. Este ensaio demonstrou que BiP interage eficientemente com a subunidade de - conglicinina em leveduras. A partir desses resultados, surgiu a hipótese de que um aumento da expressão de BiP poderia resultar em elevação do teor de proteína das sementes. O efeito da superexpressão da proteína BiP no teor de proteína total foi diretamente avaliado em sementes de Nicotiana tabacum transgênicas (geração T4) superexpressando o gene BiP da soja. Embora o nível de BiP nas sementes transgênicas, detectado por immunoblotting e quantificado por densitometria, tenha sido maior nas linhagens transgênicas senso em relação às controle e anti-senso, a superprodução constitutiva de BiP não foi correlacionada diretamente com o aumento do teor protéico, determinado pelo método Kjeldahl. Esses resultados sugerem que a capacidade de processamento do retículo endoplasmático em tabaco durante o desenvolvimento da semente não constitui o fator limitante do processo de síntese e acúmulo de proteínas de reserva.Item Purificação e atividade antibacteriana de peptídios sintetizados durante a germinação de sementes de soja (Glycine Max [L.] Merrill)(Universidade Federal de Viçosa, 2004-07-30) Barbosa, Meire de Oliveira; Pereira, Maria Cristina Baracat; http://lattes.cnpq.br/3245761154557285Peptídios antimicrobianos (AMPs) são produzidos por animais, plantas, insetos e outros organismos como estratégia de defesa eficiente, flexível, com consumo mínimo de energia e biomassa, em função de seu pequeno tamanho. Em vegetais, foram identificadas dez famílias de AMPs como parte da barreira constitutiva de defesa da planta, com massas moleculares que variam de 2 a 9 kDa. Este trabalho visou identificar e purificar peptídios de sementes de soja sintetizados durante a germinação e avaliar a atividade antibacteriana, com o objetivo de desenvolver defensivos agrícolas naturais e agentes antimicrobianos para as indústrias farmacêutica e veterinária. Sementes de soja da variedade UFV 16 (Glycine max [L.] Merrill) foram germinadas por 24, 48, 72 e 96 h, trituradas e maceradas em 2,5 volumes do tampão Tris-HCl 0,1 M, pH 7,0 contendo EDTA, PMSF e benzamidina. As sementes não germinadas foram moídas e adicionadas de tampão fosfato de sódio 25 mM na proporção de 1:5, contendo KCL, EDTA, tiouréia, PMSF e benzamidina. Os homogenatos de ambas foram mantidos sob agitação branda em geladeira por 2 h, centrifugados, e os sobrenadantes foram precipitados com sulfato de amônio. Cada sobrenadante foi aquecido a 80oC/15 min para precipitação diferencial de proteínas, e centrifugado. Seguiu-se cromatografia de troca aniônica em coluna DEAE-Sepharose com tampão Tris-HCl 25 mM, pH 7,0, em equipamento tipo FPLC. O pool catiônico obtido foi submetido à cromatografia de troca catiônica em coluna CM-Sepharose com tampão MES 25 mM, pH 6,0, em equipamento tipo FPLC, e o pico eluído em 0,35 M de NaCl foi submetido à cromatografia de fase reversa em coluna C18-HPLC. Os perfis obtidos após cromatografia de fase reversa das sementes germinadas e não germinadas foram comparados para análise dos AMPs sintetizados durante a germinação. A semente germinada por 48 h mostrou duas regiões de síntese de diferentes proteínas. Foram realizados testes de atividade antimicrobiana utilizando o pool catiônico após troca aniônica e o pico eluído com 0,35 M de NaCl após troca catiônica, para as bactérias fitopatogênicas Ralstonia solanacearum (gram-negativa) e Clavibacter michiganensis subsp. michiganensis (gram- positiva), mostrando inibição parcial e total para os extratos após troca aniônica e catiônica, respectivamente. Paralelamente, análises de espectrometria de massa com os extratos obtidos após RP-HPLC indicaram a presença de peptídio de 1 a 9 kDa e de proteína de massa maior que 20 kDa, em regiões do perfil cromatográfico correspondentes à eluição em concentrações inferiores e superiores a 40% de acetonitrila, respectivamente. Outros picos peptídicos sintetizados durante a germinação por 48, estão sendo submetidos a análises de espectrometria de massa, seqüenciamento e testes antimicrobianos, visando selecionar peptídios efetivos contra fitopatógenos de interesse.Item Estudos comparativos de modelos animais submetidos a disfunções lipídicas (hiperlipidemia) pela ação de compostos naturais (flavonóides e corantes)(Universidade Federal de Viçosa, 2004-08-17) Lima, Leonardo Ramos Paes de; Oliveira, Tânia Toledo de; http://lattes.cnpq.br/0384513283728541Realizaram-se 4 ensaios biológicos e 1 in vitro com a finalidade de se avaliar as ações farmacológicas de flavonóides e corantes naturais sobre o metabolismo lipídico. Inicialmente, avaliou-se qual espécie animal, entre coelhos da variedade Nova Zelândia, ratos machos da variedade Wistar e Cobaias (Cavia porcellus), seriam melhores para a indução da hiperlipidemia, através da administração de ácido cólico e colesterol juntamente com a ração específica para cada espécie e água ad libitun. O sangue foi coletado aos 30 e 60 dias após o início do tratamento e analisados os teores de colesterol, colesterol-HDL, triacilgliceróis e glicose no soro desses animais. Após o término dos experimentos, foram coletadas amostras de fígado e arco aórtico dos animais, numa repetição de quatro amostras para cada grupo, escolhidos ao acaso, a fim de proceder à análise histopatológica. Neste ensaio, a indução mais eficiente em provocar a hiperlipidemia foi conseguida nos coelhos, mostrando níveis séricos extremamente altos em um curto intervalo de tempo, o que o faz ser um dos animais mais procurado atualmente para trabalhos com esta finalidade. Em posse dos resultados, montou-se o segundo ensaio biológico, optando-se então por utilizar coelhos da raça Nova Zelândia na determinação da melhor via de administração dos flavonóides e corantes naturais, que são utilizados atualmente no estudo de seus efeitos farmacológicos como agentes hipolipidêmicos. De acordo com o que foi observado e pela praticidade na administração, optou-se por administrar as substâncias a serem testadas, pela via oral, nos outros experimentos. Um terceiro ensaio biológico foi realizado no intuito de se determinar a melhor concentração na qual os flavonóides e corantes atuam como fármacos hipolipidêmicos. Os tratamentos foram constituídos por dois grupos controles, sendo um grupo alimentado só com ração e o outro com ração + colesterol + ácido cólico (RCA), e por outros 16 grupos que receberam as seguintes substâncias: quercetina, rutina, morina e naringenina, nas doses e 5 mg, 10 mg, 15 mg e 30 mg. A administração destas substâncias foi pela via oral, sendo ministradas em cápsulas tendo o talco farmacêutico como veículo. As melhores reduções conseguidas na diminuição do nível do colesterol total em relação ao grupo hiperlipidêmico foram observadas nos tratamentos com quercetina e rutina na dose de 5 mg e naringenina na dose de 10 mg, sendo estas variações de 56,42%, 55,00% e 54,04%, respectivamente, sendo significativo pelo teste de Dunnett. O melhor tratamento encontrado na redução dos níveis triglicêmicos foi o com quercetina a 10 mg, sendo que este tratamento abaixou o nível de triacilglicerol destes animais em 77,51% quando comparado com o grupo hipertriglicêmico. Em relação ao colesterol-HDL, foi considerada mais eficiente a substância que promoveu um maior aumento no nível deste constituinte no soro, que foi conseguido pelo tratamento com a morina nas dosagens de 10 e 15 mg, obtendo-se um aumento de 10,79% e 9,00%, respectivamente, em relação ao grupo hiperlipidêmico. Em um último ensaio biológico, comparou-se os efeitos dos flavonóides baicaleína, morina, naringenina, naringina, quercetina, rutina, crisina, luteolina e apigenina, os corantes naturais do extraídos do urucum norbixina e bixina e o medicamento comercial hipolipidêmico colestiramina na dosagem de 10 mg/Kg de peso corporal, por via oral, em cápsula, utilizando o talco como veículo. Sendo esta forma de mais fácil manejo, menos sacrificante para o animal e com uma maior garantia das concentrações ingeridas. A indução da hiperlipidemia foi através do ácido cólico e colesterol, colocados na ração diária dos animais. Esta forma de indução é mais próxima da real e menos sacrificante para o animal. Todas as substâncias reduziram os teores de colesterol no soro sanguíneo dos coelhos, sendo que as melhores reduções foram observadas nas substâncias naringenina, 54,04%, naringina, 49,26%, quercetina, 49,78%, rutina, 48,89%, crisina, 55,56%, luteolina, 52,58% e apigenina, 49,88. Todos os flavonóides estudados e o corante bixina reduziram os níveis de colesterol a valores inferiores ao do medicamento colestiramina e sua média foi estatisticamente diferente a médias deste medicamento, pelo teste de Tukey. Estes resultados mostram que as substâncias estudadas podem ser mais eficientes no combate a hipercolesterolemias dos que os medicamentos atualmente no mercado, com a vantagem de serem menos tóxicos que estes. Os melhores efeitos observados na redução do triacilglicerol plasmático foram conseguidos pelos flavonóides baicaleína, quercetina e crisina. A baicaleína e a rutina diminuíram os níveis de triacilglicerol a valores inferiores ao do grupo controle alimentado apenas com ração, sendo que os valores conseguidos pela baicaleína (-56,91%) foram estatisticamente diferente deste grupo controle pelo teste de Dunnett. A maior parte dos flavonóides aqui estudados teve um melhor efeito sobre o triacilglicerol do que o medicamento colestiramina. As substâncias que promoveram um maior aumento no nível de colesterol-HDL foram os flavonóides baicaleína, apigenina, morina e luteolina e o medicamento colestiramina. Estas substâncias tiveram um efeito hipercolesterolêmico para esta fração lipídica do colesterol, que foram de 122,21%, 281,63%, 10,79%, 21,14% e 37,26%, respectivamente. De uma maneira geral, pode-se observar que as substâncias estudadas apresentaram uma ação farmacológica bastante acentuada no metabolismo lipídico de coelhos hiperlipidêmicos sem, sobretudo, causar efeitos de toxicidade, aparentemente. No ensaio in vitro, procurou-se caracterizar o efeito das substâncias estudadas sobre a atividade da lipase, variando-se a concentração dos modificadores, sendo que todos eles aumentaram esta atividade. Este trabalho demonstrou os efeitos benéficos de alguns flavonóides e corantes naturais sob o metabolismo lipídico de coelhos, sendo que um dos mecanismos para explicar os níveis reduzidos de triacilgliceróis é o aumento da atividade da lipase por essas substâncias, porém, novas pesquisas devem ser realizadas para que estes compostos possam ser utilizados como medicamento e testados no homem.Item Efeitos de alendronato de sódio, atorvastatina cálcica e ipriflavona, isoladamente e em associação, na osteoporose induzida com dexametasona(Universidade Federal de Viçosa, 2004-09-14) Pinto, Aloísio da Silva; Oliveira, Tânia Toledo de; http://lattes.cnpq.br/9748207181000775Este trabalho consistiu de dois ensaios biológicos com o objetivo de estudar as influências do bifosfonato alendronato de sódio, da estatina atorvastatina cálcica e do flavonóide ipriflavona, isoladamente e em associação, na osteoporose induzida pelo glicocorticóide dexametasona, em ratas da raça Wistar, adultas, pesando 250 ± 20g. O processo da indução da osteoporose consistiu na administração de dexametasona, na dose de 7 mg/kg de peso corporal, por via IM, uma vez por semana, durante cinco semanas, nos seis animais de todos os grupos, à exceção dos animais que constituiu o grupo controle (G1), que receberam, via IM, solução de NaCl à 0,9%. Os animais do grupo 2 (G2), chamado osteoporótico, receberam apenas dexametasona; Após a indução, iniciou-se os tratamentos. No primeiro ensaio, o grupo 3 (G3) que recebeu dexametasona mais alendronato de sódio na dose de 0,2 mg/kg; grupo 4 (G4) que recebeu dexametasona mais atorvastatina cálcica na dose de 1,2 mg/kg e grupo 5 (G5) que recebeu dexametasona mais ipriflavona na dose de 100 mg/kg. No segundo ensaio, procedeu as combinações das respectivas substâncias, sendo: (G3) que recebeu dexametasona mais alendronato de sódio a 0,1 mg/kg + atorvastatina cálcica a 0,6 mg/kg; (G4) que recebeu dexametasona mais alendronato de sódio a 0,1 mg/kg + ipriflavona a 50 mg/kg e (G5) que recebeu dexametasona mais atorvastatina cálcica a 0,6 mg/kg + iprilfavona a 50 mg/kg. Todas as substâncias foram administradas por via oral, diariamente. Nos períodos de 7, 14, 21 e 28 dias, após o início dos tratamentos, foram coletados amostras de sangue para dosagens de cálcio e fósforo no equipamento multiparamétrico de bioquímica Alizé com “kits” da marca BioMerieux, e fosfatase alcalina óssea no equipamento de quimioluminescência Access Immunoassay System da Beckman Coulter com “kits” Ostase. Após o sacrifício, foi coletado fêmur direito de cada animal que, uma vez processado rotineiramente e obtido as lâminas, cujos cortes foram corados com hematoxilina e eosina, foi estudado histologicamente em microscopia de luz. Procedeu-se o cálculo percentual da densidade trabecular óssea, à partir da imagem amostral de osso trabecular, contida na região subcondral, de cada corte histológico, em microscópio óptico equipado com câmara digital (TCL-984 P), analisada em monitor de microcomputador de 14 polegadas, utilizando-se da técnica de histomorfometria de contagem de pontos. Os ensaios biológicos foram realizados segundo delineamento inteiramente casualizado, com cinco tratamentos em seis repetições. Os resultados obtidos foram submetidos à análise de variância e ao teste F (p<0,05). Os grupos controles (G1 e G2) foram comparados entre si, por meio do teste F. Os grupos tratados (G3, G4 e G5) foram comparados entre si, através do teste de Tukey à 5% de probabilidade. As comparações também foram realizadas entre os grupos tratados e os controles G1 e G2, sendo que, para o mesmo, foi aplicado o teste de Dunnet à 5% de probabilidade. Os resultados não mostraram diferenças significativas entre o grupo controle (G1) e o grupo osteoporótico (G2), bem como, entre eles e os grupos tratados (G3, G4 e G5) e, também, entre os grupos tratados entre si, em todos os períodos, quanto aos valores sérico de cálcio, fósforo e fosfatase alcalina óssea, tanto no primeiro, como no segundo ensaio biológico. Assim, estes marcadores bioquímicos não apresentaram indícios para condução de diagnóstico e acompanhamento da patologia óssea osteoporótica. Todavia, os valores percentuais de densidade trabecular óssea foram significativos em todos os períodos, quando se compara o G1, (±60%), com G2, (±40%), mostrando que a indução osteoporótica com o glicocorticóide dexametasona foi um sucesso. Quanto aos grupos tratados, comparados com o G2, constata-se que os tratamentos com alendronato de sódio (G3) e atorvastatina cálcica (G4), isoladamente, alcançaram valores percentuais de densidade trabecular óssea significativos, já no período de 14 dias, repetindo-se nos períodos de 21 e 28 dias e o tratamento com ipriflavona obteve valores significativos nos períodos de 21 e 28 dias. O grupo tratado com alendronato de sódio obteve valores semelhantes ao do grupo controle (G1), nos períodos de 21 e 28 dias. Demonstra-se, assim, a capacidade destas substâncias de restaurar o tecido trabecular ósseo nos animais osteoporóticos induzidos com glicocorticóide. As associações, por sua vez, apresentaram resultados superiores. Todos os grupos tratados (G3, G4 e G5) apresentaram resultados significativos em relação ao grupo (G2) nos períodos de 14, 21 e 28 dias. Ademais, o grupo G4 (alendronato + ipriflavona) mostrou valores significativos, acima dos apresentados pelo grupo controle (G1), que é constituído de animais normais, nos períodos de 14, 21 e 28 dias e o grupo G3 (alendronato + atorvastastina), nos períodos de 21 e 28 dias. Tornou-se evidente, que as associações resultaram em maior eficácia, particularmente, aquelas com alendronato, com capacidade de restaurar o tecido trabecular ósseo. Considerando que as doses individuais das substâncias associadas foram reduzidas à metade daquelas, quando administradas isoladamente, e os resultados foram superiores, caracteriza-se, assim, efeito sinérgico de supradição ou potenciação farmacológica. Muito embora os marcadores bioquímicos utilizados neste trabalho não demonstraram diferenças que evidenciasse alteração metabólica óssea, a histomorfometria e a histopatologia permitiu análise estática e dinâmica, bem como a avaliação das alterações tissulares na unidade metabólica óssea, especialmente, no osso trabecular. Deste modo, as substâncias usadas isoladamente ou as suas associações, podem ser promissoras no tratamento prolongado com glicocorticóide ou no tratamento da osteoporose estabelecida. Ressalva-se, no entanto, que estudos posteriores das dosagens, interações, biodisponibilidades, além dos efeitos toxicológicos dessas substâncias farmacológicas, fazem-se necessários.Item Obtenção de primers microssatélite e desenvolvimento, validação e mapeamento de marcadores SCAR em feijoeiro-comum(Universidade Federal de Viçosa, 2004-09-20) Queiroz, Vagner Tebaldi de; Moreira, Maurilio Alves; http://lattes.cnpq.br/9963384168622230Embora apresente várias limitações, a técnica de RAPD ainda representa a principal ferramenta utilizada no Programa de Melhoramento Genético do Feijoeiro- comum BIOAGRO/UFV. Para contornar os problemas apresentados por esta técnica, a estratégia utilizada por vários pesquisadores tem sido a conversão dos marcadores RAPD em marcadores SCAR e o desenvolvimento de primers microssatélite. Assim, no presente trabalho foram desenvolvidos 5 primers SCAR para mancha-angular, 5 primers para ferrugem e 7 primers para antracnose. Os primers desenvolvidos para mancha-angular derivaram-se dos marcadores OPM02 425 , OPBA16 669 , OPH13 490 e OPH14+AA19 400 e foram mapeados, em acoplamento, a 5,3, 7,1, 5,6 e 10,1 cM, dos respectivos genes de resistência. Os primers desenvolvidos para ferrugem originaram-se dos marcadores OPAE19 890 , OPX11 550 , OPAJ18+AH10 700 , mas apenas o primer sAE19 foi validado. Este foi mapeado, em repulsão, a 1,0 cM do gene de resistência Ur-11. Os primers para antracnose foram desenvolvidos, a partir da seqüência dos fragmentos OPAZ20 940 , OPY20 830 , OPC08 900 , OPZ04 560 , OPB03 1800 , OPZ09 950 , OPH18 830 . Destes, apenas os primers sAZ20, sY20, sC08, sZ04 foram mapeados, em acoplamento, a 7,1, 1,2, 7,8 e 2,9 cM, dos respectivos genes de resistência. Os primers microssatélite foram desenvolvidos, a partir das seqüências de fragmentos de DNA genômico de 3 pequenas bibliotecas enriquecidas. As bibliotecas enriquecidas para as repetições GGC, CCA e AT permitiram a seleção de 79, 172 e 50 clones positivos, respectivamente. Do total de 301 clones que foram identificados, 153 já foram seqüenciados. Observou-se que 40 (26%) clones seqüenciados apresentaram fragmentos de DNA contendo microssatélite, os quais variaram quanto ao tipo, número e tamanho. As seqüências apresentaram repetições de di-, tri-, tetra- e até pentanucleotídeos. Em um mesmo fragmento, foram encontrados até 3 microssatélites. Entre as seqüências analisadas, foram observadas repetições perfeitas, imperfeitas e compostas, variarando entre 12 e 24 pb. Até o momento, foram desenhados e testados 10 pares de primers, sendo um deles originado da seqüência do marcador RAPD OPAZ20 940 . Destes, apenas 5 pares (FCctc001, FCggc001, FCccg001, FCccg002 e FCgca001) amplificaram fragmentos com tamanho esperado e bem definidos. Entretanto, esses primers foram monofórficos, quando testados entre diferentes cultivares andinos e mesoamericanos. Os primers SCAR, desenvolvidos e validados no presente trabalho, foram testados juntamente com 45 pares de primers microssatélite comerciais, entre os genitores de uma população de 154 RIL ́s. Dos primers selecionados, 7 foram mapeados em 10 grupos de um mapa parcial de ligação já existente e 1 permaneceu não-ligado. O mapa de ligação sofreu pequena variação no tamanho (247,8/252 cM) e no número de grupos de ligação (9/10 grupos). Entretanto, pela análise de variância foram constatadas associações significativas desses marcadores com diferentes características quantitativas. As associações mais significativas foram constatadas por meio de análises de regressão stepwise, as quais promoveram alteração no valor de R 2 da regressão múltipla para algumas das características. As características MAT (número de dias até a maturação), VAPLA (número médio de vagens por planta), SEPLA (número médio de sementes por planta) e PRVAG (produção média por vagem), que apresentavam valores de R 2 de 40,14; 28,99; 14,03 e 17,13 , tiveram um aumento para 44,30; 34,53; 21,92 e 26,03, respectivamente. A inclusão do marcador sH13 no GL 07 possibilitou a identificação de um novo QTL para a característica VAPLA. Este marcador também mostrou-se associado ao QTL, anteriormente, descrito para SEPLA. O marcador BM165 foi mapeado no GL 02 e mostrou-se associado a 4 QTLs diferentes, identificados para as características MAT, P100 (peso de 100 sementes), SEPLA e PRVAG.