Purificação e caracterização de α-galactosidases do fungo Penicillium griseoroseum para utilização na hidrólise de oligossacarídeos de rafinose em derivados de soja

Abstract

O objetivo deste trabalho foi avaliar a eficiência das α-galactosidases purificadas do fungo Penicillium griseoroseum na hidrólise dos RO presentes no extrato desengordurado de soja. Penicillium griseoroseum foi cultivado em meio mineral, contendo galactomanana como fonte de carbono, por 120 h, a 28 oC. Após este período, o meio foi centrifugado, dialisado e utilizado como fonte de enzimas α-galactosidases. Os extratos enzimáticos foram submetidos à cromatografia de troca iônica em DEAE-Sepharose, pH 5,0. A eluição das proteínas que aderiram a resina foi feita com um gradiente de NaCl de 0 a 0,3 M, sendo detectado dois picos protéicos distintos contendo atividade α-galactosidase, sendo a enzima detectada o primeiro pico protéico eluído denominada α-Gal I e enzima eluída no segundo pico denominada α-Gal II. As frações contendo as enzimas α-Gal I e α-Gal II foram reunidas, concentradas por ultrafiltração e submetidas a uma eletroforese em gel de poliacrilamida, sob condições não desnaturantes. Ao termino das corridas eletroforéticas, os géis foram incubados em uma solução de ρ-NP-αGal (4 mg.mL-1) para determinar a localização das enzimas α-galactosidases. As regiões dos géis contendo as enzimas α-Gal I e α-Gal II, foram recortadas, maceradas e submetidas a agitação em tampão acetato de sódio, pH 5, 100 mM para extração e obtenção das enzimas purificadas. As enzimas α-Gal I e α-Gal II tiveram fatores de purificação de 155 e 53 vezes, respectivamente, com um rendimento final de 38 e 9 %, respectivamente. Atividades máximas de ambas as enzimas foram detectadas em pH 5,0 a 45oC. Os valores de meia vida da enzima α-Gal I a 40 e 45°C foram de 16 e 0,66 h respectivamente. Os valores de meia-vida da enzima α-Gal II a 40 e 45°C foram de 3,8 e 0,25 h respectivamente. Os valores da KM para ρ-NP-αGal, ο-PN-αGal, melibiose, estaquiose e rafinose para a enzima α-Gal I foram de 1,06, 1,31, 4,77, 19,99 e 28,74 mM, respectivamente, enquanto que, para a enzima α-Gal II foram de 0,80, 1,26, 5,10, 21,74 e 30,46 mM, respectivamente. As α-galactosidases apresentaram especificidade absoluta para galactose em posição α, hidrolisando os substratos sintéticos ρ-NP-αGal, ο-NP-αGal, estaquiose, rafinose, melibiose. Sulfato de cobre, sulfato de ferro e cloreto de mercúrio inativaram completamente as α-galactosidases quando presentes em concentrações iguais 1 mM no meio de reação. Os resultados dos tratamentos de extrato desengordurado de soja com as enzimas α-Gal I e α-Gal mostraram uma redução de 100% de estaquiose pós-incubação a 40 oC, por 8 h. Houve redução de 69 e 12 % da rafinose após 8 h de incubação, a 40 oC, com as enzima α-Gal I e α-Gal II, respectivamente. A enzima α-Gal I foi imobilizada em suporte insolúvel (sílica modificada) e utilizada em ensaios de hidrólise de RO contidos em extrato desengordurado de soja, sendo verificado uma redução de 100 e 70% de estaquiose e rafinose, respectivamente, após 8 h de incubação. A enzima α-Gal I foi reutilizada 8 vezes consecutivas, em ensaios de hidrólise de RO, não sendo detectada nenhuma perda de atividade enzimática. Observa-se que as α-galactosidases de P. griseoroseum foram eficientes na redução dos RO presentes em produtos derivados de soja, sendo indicadas para a utilização industrial no processamento desses açúcares.The present work aims to evaluate the efficiency of the purified α-galactosidases from Penicillium griseoroseum in the hydrolysis of the RO present in the free fat soy extract. Penicillium griseoroseum was cultivated in a mineral medium which contained galactomanana as a source of carbone, for 120 hours, at 28 oC. After this period, the medium was dialysed, centrifuged and used as a source of enzymes α-galactosidases. The enzymatic extracts were submitted to the chromatography in DEAE-Sepharose, pH 5.0. Adsorbed proteins were liberated with linear increasing gradient of NaCl (0-0,3 M) and two peaks containing α-galactosidase activity was detected. The enzyme detected on first peak was denominated α-Gal I and the enzyme detected on second peak was denominated α-Gal II. α-Galactosidase active fractions were pooled and concentrated by ultrafiltration cell using 10 kDa cut-off membrane. Concentrated samples were submitted in a native electrophoresis polyacrylamide gel and in the end of the electrophoresis the gel was incubated with ρ-NP-αGal solution (4 mg.mL.-1) to visualizing of the enzymes α-galactosidases. The places containing the enzymes α-galactosidases were cut off, macerated with 100 mM sodium acetate buffer (pH 5) and kept under agitation for 24 h to extracting the purified enzymes. The enzymes α-Gal I and α-Gal II got purification factors of 155 and 53 times, respectively, with a final result of 38 and 9 %, respectively. The maximum activities of the α-Gal I and α-Gal II were detected in pH 5.0 at 45 oC. The values of half-life to α-Gal I at 40 and 45 °C were 16 and 0,66 h respectively. The values of half-life to α-Gal II at 40 and 45 °C were 3,8 and 0,25 h respectively. The values of KM for ρ-NP-αGal, ο-NP-αGal, melibiose, stachyose and raffinose for the α-Gal I were 1,06, 1,31, 4,77, 19,99 e 28,74 mM, respectively, while for the α-Gal II were 0,80, 1,26, 5,10, 21,74 e 30,46 mM, respectively. The α-galactosidases presented absolute specification for galactose in α position, hydrolysing the substrates ρ-NP-αGal, ο-NP-αGal, stachyose, raffinose, melibiose. Copper sulphate, iron sulphate and silver nitrate completely deactivated the α-galactosidases from P. griseoroseum in a concentration of the 1 mM. The results of the treatments of free fat soy extract with enzymes α-Gal I and α-Gal II demonstrated a reduction of 100 % of the stachyose after 8 h of incubation at 40 oC. There were 69 and 12% of reduction of the raffinose after 8 h of incubation at 60 oC, with the enzyme α-Gal I and α-Gal II, respectively. The enzyme α-Gal I was immobilized in insoluble support (modified silica) and used in assays of hydrolysis of RO present in free fat soy extract. The immobilized enzyme hydrolysed 100 and 70% of stachyose and raffinose, respectively, after 8 h of incubation. The immobilized enzyme α-Gal I was reapplied 8 times consecutively in hydrolysis treatment without loss in its activity. Therefore, it can be observed that the α-galactosidases of P. griseoroseum were efficient in reducing the RO presents in soy derived products, and they are appropriate to industrial use in the processing of these sugars.