Biologia Celular e Estrutural
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Item Production, characterization and evaluation of the chemotherapeutic and immunogenic potential of protein based virus-like particles in tumoral and immune cell lines(Universidade Federal de Viçosa, 2023-10-30) Gonçalves, Amanda Patrícia; Santos, Anésia Aparecida; http://lattes.cnpq.br/6365400804665140In this thesis, nanotechnology was used to develop three inedited platforms with clinical applications. Results are presented in three chapters written in article format. In the first chapter, in vitro assays are used to characterize a new doxorubicin (DOX) carrier virus-like platform and to evaluate the cell effects of murine melanoma cells treated with free DOX or carried DOX. It is showed that carried DOX promotes higher cell death rates and enter cells in a different manner whether compared with free DOX. In the second chapter, the Spy Catcher/Spy Tag technology was used to conjugate different peptides to rod-shaped virus-like particles (VLPs). It is shown that two different types of antigen-presenting cells (APCs) can take up decorated VLPs and this promotes the activation of immune response by increasing CD80 and CD86 expression. In the third chapter, Spy Catcher/Spy Tag technology was also used to conjugate anti-EGFR nanobodies to the surface of DOX-loaded VLPs. It is shown that particles displaying anti-EGFR nanobodies promote a more accentuated decrease on cell viability of human colorectal cancer cells whether compared with non-decorated particles. In conclusion, this work present the full production and characterization of three distinct nanoplatforms and a solid in vitro evaluation of a range of cell mechanisms such as endocytosis, apoptosis and autophagy. The achieved results suggest that the constructions presented here have features that put them as nanoplatforms with potential clinical applications such as vaccine platforms and drug delivery systems. Keywords: Nanotechnology. Drug-delivery systems. Vaccine platforms. Protein-based particles. Nucleic acid-based particles. Particle decoration. Doxorubicin. Cancer.Item Efeito de extratos vegetais no reparo ósseo e cutâneo em modelos animais(Universidade Federal de Viçosa, 2018-07-31) Miranda, Lyvia Lopes; Gonçalves, Reggiani Vilela; http://lattes.cnpq.br/9559174169706814O reparo de lesões teciduais é um processo biológico natural essencial para a sobrevivência de todos os organismos superiores. A utilização de produtos naturais para tratamento de lesões vem crescendo em todo o mundo, pois representam uma alternativa eficaz e com baixos efeitos colaterais para os indivíduos. Esse estudo teve por objetivo investigar o efeito de extratos vegetais na cicatrização de fraturas ósseas e feridas cutâneas em animais. Esta dissertação é composta por dois artigos. No artigo 1, foi realizada uma revisão sistemática. Foram selecionados 27 estudos que avaliaram o efeito do extrato de plantas no reparo ósseo. A avaliação da qualidade dos estudos incluídos foi realizada utilizando os critérios descritos nas diretrizes ARRIVE para Relatórios de Pesquisa Animal. Apesar da grande variação entre alguns parâmetros analisados na revisão sistemática, os animais tratados com espécies vegetais, no geral, apresentaram resultados positivos quanto à estimulação da proliferação celular. O artigo 2, consistiu em uma investigação experimental, onde vinte e cinco ratos Wistar (±349g), com três meses de vida, foram obtidos do Biotério Central da Universidade Federal de Viçosa e individualizados em gaiolas com alimento e água ad libitum. Após anestesia, foram feitas duas feridas por queimadura (12 mm de diâmetro) no dorso de cada animal, os quais foram igualmente randomizados em cinco tratamentos: Sal: salina; VP: veículo da pomada (lanolina e vaselina); SS: controle positivo (sulfadiazina de prata 1%); PB1: pomada B. oleracea a 10%; e PB2: pomada B. oleracea a 20%. Os animais foram tratados com a pomada, diariamente, durante oito dias. A pomada à base do extrato de Brassica oleracea var. capitata nas concentrações 10 e 20% promoveu maior celularidade, vascularização, bem como aumento dos componentes fibrosos da matriz extracelular, aumentando a expressão das enzimas antioxidantes. Nossos achados demonstraram por meio da revisão sistemática que extratos vegetais estimulam o reparo ósseo e, o estudo experimental evidenciou a eficácia da pomada a base do extrato de Brassica oleracea na aceleração da cicatrização de feridas por queimadura em ratos Wistar.Item Citogenética clássica e molecular com ênfase na evolução cromossômica em Meliponini(Universidade Federal de Viçosa, 2018-07-31) Travenzoli, Natália Martins; Salomão, Tânia Maria Fernandes; http://lattes.cnpq.br/8388545717303606Os Meliponini são um grupo é monofilético, em que as espécies Neotropicais formam um grupo irmão com as espécies Afrotropicais e Indo-Malaia-Australásia. Citogeneticamente, a maioria dos estudos está relacionada à descrição do número de cromossomos nas espécies Neotropicais (n=8 a 22 cromossomos, predominando n=17 e n=18). Para as demais espécies da Tribo, essa descrição está restrita a cinco espécies Afrotropicais (n=17 e n=18) e uma única espécie da região Indo-Malaia- Australásia (n=20). Baseada nos números cromossômicos dessas espécies, a Teoria da Interação Mínima (TIM) passou a ser a mais aceita para explicar a evolução cromossômica em abelhas dessa Tribo. Segundo essa proposta, o ancestral das espécies viventes apresentaria baixo número cromossômico, o qual aumentaria ao longo da evolução por fissões com posterior acúmulo de heterocromatina. Consequentemente os cromossomos dessas espécies apresentaria um braço cromossômico eucromático e outro heterocromático. Uma exceção ao padrão foi observada em Melipona, que possui espécies com baixo e alto teor de heterocromatina. Nesse contexto, os padrões heterocromáticos em Meliponini e a predominância do alto número cromossômico (n=17 e n=18) são características de interesse a serem investigadas nessa Tribo. Assim, os objetivos desse estudo foram: (i) inferir o número cromossômico ancestral entre as espécies de Meliponini, bem como a do grupo irmão Bombini, a fim de propor hipóteses de evolução relacionadas às alterações cromossômicas; (ii) descrever o cariótipo de Austroplebeia australis baseados no número cromossômico, padrão heterocromático, riqueza em pares de base Citosina-Guanina e Adenina-Timina e o mapeamento dos sítios de rDNA, microssatélites GA (15), GAG (10) , CAA (10) CGG (10) e as regiões teloméricas TTAGG (6) ; (iii) caracterizar o cariótipo de Melipona (Melikerria) interrupta com base nos padrões heterocromáticos e as regiões ricas em pares de base Citosina-Guanina (CG) e Adenina-Timina (AT) nos cromossomos, bem como o mapeamento dos sítios de rDNA, microssatélites GA (15), GAG (10) , CAA (10) CGG (10) e as regiões teloméricas TTAGG (6) ; (iv) realizar uma análise comparativa das informações citogenéticas existentes para Melipona e um mapeamento cromossômico das sequências de DNA repetitivas; (v) infereir o padrão heterocromático do ancestral comum das espécies de Melipona, para melhor entender o surgimento da heterocromatina e a diversificação cariotípica do gênero. Os resultados obtidos sugerem: (i) que o cariótipo ancestral entre Meliponini e Bombini possuía n=18 cromossomos e o dos Meliponini n=17 cromossomos, sendo que os números haploides inferiores se originaram por fusões adicionais; (ii) O cariótipo de A. australis possui 2n=36 cromossomos, os quais são constituídos por grande quantidade de heterocromatina. Os padrões de DAPI + - CMA 3+ divergiram do encontrado para a tribo e as sequências de DNA repetitivo hibridizaram apenas em regiões de eucromatina; (iii) Melipona (Melikerria) interrupta apresentou 2n=18 cromossomos, alto teor de heterocromatina, marcações do CMA3 + e DNA ribossomal 18S foram observadas na região intersticial próxima a junção da eucromatina e heterocromatina do primeiro par cromossômico cromossômico; (iv) Melipona possui espécies com número cromossômico conservado (2n=18) e as regiões de heterocromatina são importantes marcadores para separar as espécies do Grupo I e II, assim como o DAPI-CMA 3+ e o 18S. As sondas de DNA repetitivos foram restritas à eucromatina dos cromossomos, com padrões de distribuição distintos entre as espécies de baixo e alto teor de heterocromatina. A sequência TTAGG (6) foi observada nos telômeros dos cromossomos de Melipona; (v) observamos que o ancestral comum de Melipona possuía baixo conteúdo de heterocromatina, o qual aumentou no ancestral comum de Michmelia e independentemente em Melikerria, com diferentes constituições heterocromáticas. Concluímos que o número cromossômico ancestral n=18 se manteve ao longo da evolução em diferentes espécies da Tribo, sendo os eventos de fusão os principais responsáveis pelas variações dos números haploides. O baixo número de cromossomos encontrado em Melipona é uma apomorfia do gênero. Em A. australis, a grande quantidade de heterocromatina é semelhante ao cariótipo das espécies do Grupo II de Melipona. Entretanto, a constituição da cromatina baseada na riqueza de bases AT e CG é mais semelhante ao observado em espécies solitárias. As espécies de Melipona possuem características citogenéticas conservadas, o que possivelmente é resultado do tempo recente de diversificação dessas espécies. O baixo conteúdo heterocromático é o caráter ancestral do gênero e a alta quantidade de heterocromatina o resultado de sua amplificação a partir da região centromérica, surgindo em momentos independentes nas espécies.Item Parâmetros renais em ratos diabéticos expostos ao arsênio(Universidade Federal de Viçosa, 2018-07-26) Sertorio, Marcela Nascimento; Neves, Mariana Machado; http://lattes.cnpq.br/7324761387708120Sabe-se que a função renal pode ser influenciada tanto por contaminantes ambientais quanto por doenças metabólicas. No entanto, não está claro como estes fatores, de forma combinada, podem alterar a capacidade de filtração glomerular e de excreção de substâncias tóxicas dos rins. Neste contexto, avaliamos parâmetros morfológicos e funcionais nos rins de ratos diabéticos expostos a arsênio, um potente contaminante ambiental. Ratos Wistar machos saudáveis e ratos diabéticos, modelo experimental induzido por estreptozotocina, foram expostos a 10 mg/L de arsênio na forma de arsenato de sódio via água de beber durante 40 dias. Os constituintes do estroma e parênquima renal foram analisados por meio de morfometria. O dano funcional dos rins foi investigado por meio de marcadores de apoptose e proliferação celular, proporção de elementos químicos, marcadores de estresse oxidativo, e também através da atividade das enzimas do sistema antioxidante endógeno e das proteínas de membrana adenosina trifosfatases. A ingestão de arsenato aumentou as concentrações de glicose sérica em animais saudáveis, no entanto, este aumento não alcançou níveis de hiperglicemia. Nos animais diabéticos, este aumento não foi significativo. O arsenato foi capaz de induzir um aumento notável de nefrose glicogênica nos túbulos distais de animais diabéticos, caracterizada por grande acúmulo de glicogênio nas células tubulares. Além disso, a atividade do sistema antioxidante endógeno foi alterada, e associada a proporção dos elementos ferro, cobre e potássio no tecido renal. Foi observado aumento de peso corporal e nos rins de animais diabéticos expostos a arsenato. Nos animais diabéticos, níveis de malondialdeído, sódio, ureia, creatinina, marcadores de apoptose e proliferação, além do índice renal somático e conteúdo de água nos rins foram alterados pela diabetes isoladamente e não foram agravados pela ingestão de arsenato. Os demais parâmetros, como atividade de superóxido dismutase, níveis de proteínas carboniladas, atividade das proteínas de membrana adenosina trifosfatases e morfologia glomerular não foram modificados significativamente em nenhum dos grupos tratados. Nossos resultados mostraram que a ingestão de água contaminada por arsênio por indivíduos diabéticos possui o potencial para alterar aspectos morfofuncionais renais.Item Avaliação da ação leishmanicida de derivados do ácido cinâmico sobre Leishmania braziliensis(Universidade Federal de Viçosa, 2016-11-23) Menezes, Wemerson Aquiles; Fietto, Juliana Lopes Rangel; http://lattes.cnpq.br/5830798203379907Item Mudanças nos órgãos excretores da abelha Apis mellifera durante a metamorfose: morfogênese, remodelação, morte e proliferação celular(Universidade Federal de Viçosa, 2017-07-14) Gonçalves, Wagner Gonzaga; Serrão, José Eduardo; http://lattes.cnpq.br/8502576724635112A abelha Apis mellifera tem importância ecológica e econômica, no entanto, sofre um declínio populacional, talvez devido à exposição a compostos tóxicos, que são excretados pelos túbulos de Malpigui. Durante a metamorfose de A. mellifera, os túbulos de Malpigui degeneram e são formados de novo. O objetivo deste trabalho foi verificar os eventos celulares na renovação dos túbulos Malpighi, acompanhando na metamorfose, quais as etapas da remodelação celular, determinando os tipos celulares e seus papéis na atividade excretora e inicio do controle homeostático em A. mellifera. As análises ultraestruturais e de imunofluorescência mostraram que as células dos túbulos de Malpighi de larvas degeneraram por apoptose e autofagia (larva L5S e pré-pupa) e novos túbulos de Malpigui são formados por proliferação celular. (larva L5S e pupa de olhos castanhos). A ultraestrutura das células dos túbulos de Malpigui sugere que uma remodelação celular ocorra a partir de pupa de olhos marrons, indicando o inicio de uma atividade de excreção nos túbulos de Malpigui pupais. Em abelhas adultas (recém-emergida e forrageira), dois tipos celulares ocorrem nos túbulos de Malpigui, um com características ultraestruturais de produção da urina primária e outro tipo de célula com características que sugerem um papel na reabsorção da urina primária. Este estudo sugere que, durante a metamorfose, os túbulos de Malpigui não são funcionais até pupa de olhos castanhos, indicando que A. mellifera pode ser vulnerável a compostos tóxicos nas primeiras nas fases pupais. Além disso, a ultraestrutura celular sugere que os túbulos Malpigui podem ser funcionais a partir de pupa de olhos marrons e adquirem maior complexidade na abelha operária forrageira. Nos insetos, o intestino posterior é um órgão homeostático, sendo este dividido em piloro, íleo e reto, que reabsorvem água, íons e pequenas moléculas produzidas na filtragem da hemolinfa e nas fezes. Esse estudo reporta as mudanças morfológicas e os eventos celulares que ocorrem no intestino posterior durante a metamorfose da abelha A. mellifera. No intestino posterior, a imunolocalização de autofagossomos e a ultraestrutura as células epiteliais e do revestimento cuticular sugerem que em pré-pupa tem início a degradação cuticular, que em pupas de olhos brancos e rosas é reabsorvida e reciclada por autofagossomos, sendo a deposição da nova cutícula em pupa de olhos castanhos. Em larva L5S e pré-pupa, o intestino posterior apresenta proliferação celular em suas extremidades anterior e posterior. Na pupa, as regiões do piloro, íleo e reto estão evidentes e com proliferações celulares que cessam a partir de pupa de olhos marrons. Apoptose ocorre de larva L5S até pupa de olhos rosas. Em pupas de olhos castanhos e marrons, o epitélio do íleo muda de pseudoestratificado para simples somente após a produção da lâmina basal e o epitélio retal é achatado. Nas células do íleo de pupa de olhos pretos ocorrem grandes vacúolos e espaços subcuticulares, enquanto que na operária adulta forrageira, ocorrem invaginações apicais longas e muitas mitocôndrias, sugerindo uma atividade no transporte de compostos. Os resultados mostram que a morfogênese do intestino posterior é dinâmica, com remodelações teciduais e eventos celulares para a formação de diferentes regiões do órgão, reconstrução de uma nova cutícula e remodelação dos músculos viscerais.Item Efeitos do arsênio em parâmetros hepáticos e reprodutivos de ratos Wistar saudáveis e diabéticos(Universidade Federal de Viçosa, 2018-02-08) Souza, Ana Cláudia Ferreira; Neves, Mariana Machado; http://lattes.cnpq.br/9375636564821511É conhecido que a exposição ao arsênio ou a hiperglicemia pode causar alterações sistêmicas, comprometendo a função e a estrutura dos órgãos. No entanto, não está claro a extensão na qual este metaloide, na presença de uma disfunção metabólica preexistente, poderia afetar a morfologia e função dos órgãos. Portanto, o objetivo deste trabalho foi avaliar parâmetros hepáticos e reprodutivos de ratos normais e diabéticos expostos ao arsênio. Para isso, a diabetes foi induzida em ratos machos utilizando injeção intraperitoneal de estreptozotocina. Os animais saudáveis e hiperglicêmicos receberam solução salina (controle negativo; controle diabetes) ou 10 mg/L de arsênio na forma de arsenato de sódio (controle arsênio; diabetes + arsênio) na água de beber por 40 dias ad libitum. A exposição ao arsenato aumentou os níveis de glicose sérica em animais saudáveis comparados aos animais do grupo controle negativo. No entanto, a exposição a este composto de arsênio não intensificou os níveis de glicose já elevados dos animais diabéticos. No fígado, a atividade das enzimas antioxidantes foi reduzida após exposição ao arsenato em animais saudáveis comparados aos animais do grupo controle negativo, enquanto a combinação de diabetes e arsenato agravou a redução da enzima glutationa s- transferase. Consequentemente, os animais expostos ao arsenato apresentaram níveis aumentados de malondialdeido e proteína carbonilada, sendo este aumento intensificado em animais com diabetes pré-existente. Além disso, estes animais apresentaram níveis séricos aumentados de fosfatase alcalina. A exposição ao arsenato causou um processo inflamatório no tecido hepático de animais saudáveis comparados aos animais do grupo controle negativo. Do mesmo modo, a exposição ao arsenato realçou o aumento de infiltrado inflamatório nos animais diabéticos, com alto número de mastócitos e produção de TNF-α. Em adição, alterações vasculares tais como congestão, hemorragia e depósitos de hemossiderina foram intensificados nos animais do grupo diabetes + arsênio, enquanto os estoques de glicogênio foram reduzidos. Em relação ao sistema reprodutor, nós observamos que a exposição ao arsenato reduziu a concentração de testosterona sérica em animais saudáveis e agravou a redução observada em animais diabéticos. O número de espermatozoides no testículo e epidídimo, a produção diária espermática e o tempo de trânsito dos espermatozoides no epidídimo foram reduzidos também em animais saudáveis expostos ao arsenato. Além disso, a exposição a este composto de arsênio agravou estes parâmetros em ratos diabéticos. A motilidade espermática, a integridade das membranas desta célula e o número de espermatozoides normais foram também reduzidos em animais saudáveis expostos ao arsenato. A combinação de diabetes e arsenato intensificou apenas a redução do número de espermatozoides normais observado nos animais diabéticos. A proporção de arsênio aumentou no testículo e epidídimo de ambos os grupos recebendo arsenato. Além disso, a exposição ao arsenato induziu a um desequilíbrio na atividade das enzimas antioxidantes e no conteúdo de microminerais em animais saudáveis, além de realçar estas mudanças em ratos diabéticos. Mudanças morfológicas ocorreram principalmente nos animais do grupo diabetes + arsênio. Enfim, nossos resultados indicam que a exposição ao arsênio foi capaz de causar intensos danos morfológicos e funcionais no fígado e no sistema reprodutor de ratos Wistar saudáveis. Além disso, estes danos foram intensificados quando animais diabéticos foram expostos ao arsênio. Portanto, mais estudos são necessários para entender melhor o mecanismo de ação do arsênio em animais com doença metabólica pré-existente e os possíveis danos causados por este metaloide na fertilidade e metabolismo dos animais.Item Alterações morfofisiológicas em morcegos frugívoros (Artibeus lituratus) expostos à formulação comercial do inseticida deltametrina(Universidade Federal de Viçosa, 2017-08-14) Oliveira, Jerusa Maria de; Oliveira, Leandro Licursi de; http://lattes.cnpq.br/4598394373764781A Deltametrina (DTM) é um inseticida piretroide utilizado na agricultura e no controle de vetores de doenças. Resíduos desse pesticida são comumente encontrados no ambiente e podem trazer prejuízos para a saúde de organismos não-alvos, como os morcegos frugívoros. Durante o forrageio, estes animais entram em contato com esse inseticida por intermédio da água e alimentação. No entanto, a literatura científica apresenta escassez de dados que demonstram a toxicidade dos pesticidas em dos morcegos. Portanto, o objetivo deste estudo foi avaliar a toxicidade aguda de baixas concentrações do inseticida DTM no morcego frugívoro Artibeus lituratus (Olfers, 1818). Para isso, foram capturados 23 morcegos machos utilizando redes de neblina em fragmentos de Mata Atlântica - MG, Brasil. Os animais foram mantidos em gaiolas (3x3x2 m) no morcegário da Universidade Federal de Viçosa, e porções de mamão pulverizadas com solução do inseticida DTM (0; 0,02; 0,04 mg/kg de mamão), foram oferecidas diariamente aos animais, durante sete dias. Após o período de exposição, foram avaliadas as enzimas antioxidantes catalase (CAT), superóxido dismutase (SOD), glutationa S-transferase (GST), a peroxidação lipídica e as proteínas carboniladas no fígado, músculo peitoral e testículos dos morcegos. Os níveis de peróxido de hidrogênio foram mensurados no fígado e músculo peitoral e o óxido nítrico (NO) no fígado, músculo peitoral, rins e testículos. No plasma, foram mensurados a atividade da alanina aminotransferase (ALT) e aspartato aminotransferase (AST), a glicemia e as proteínas totais. Foram mensurados o percentual de glicogênio hepático, os níveis de lipídios e proteínas totais do músculo peitoral e do fígado. A imunidade inata foi avaliada por intermédio da atividade bactericida do soro e da proliferação celular de esplenócitos. Foram realizadas também avaliações histopatológicas e histomorfométricas no fígado, rim, intestino e testículos. Os morcegos mostraram estresse oxidativo no fígado, no músculo peitoral e nos testículos. No plasma, os animais apresentaram hiperglicemia e aumento das transaminases AST e ALT. O fígado também mostrou redução da reserva de glicogênio, esteatose, e histopatologias pronunciadas. No intestino ocorreu hiperplasia de células caliciformes e maior evidência de células apoptóticas. Os rins mostraram aumento de glicogênio nos túbulos proximais, infiltrados inflamatórios, nefroesclerose vascular benigna e redução dos níveis de NO. Os testículos dos morcegos expostos mostraram aumento nos níveis de NO, apoptose das células germinativas e histopatologias severas. Os parâmetros imunológicos avaliados não apresentaram alterações entre os grupos, provavelmente devido ao tempo de exposição. Portanto, esses resultados nos mostram que a exposição oral de morcegos frugívoros à baixas concentrações da formulação comercial do inseticida DTM pode alterar o metabolismo de carboidratos, causar injúrias no fígado, músculo peitoral, rins, intestino e testículos. Portanto, a DTM pode ser tóxica para morcegos frugívoros, e comprometer a saúde desses animais.Item Modelo animal de artrite e miosite induzidas pelo vírus Mayaro(Universidade Federal de Viçosa, 2017-08-04) Santos, Franciele Martins; Paula, Sérgio Oliveira de; http://lattes.cnpq.br/7758412753237265O Vírus Mayaro (MAYV) pertence ao gênero Alphavirus e a família Togaviridae. Ele está incluído no grupo dos alfavírus artritogênicos, que também compreende o Vírus Ross River (RRV), Vírus Chicungunya (CHIKV) Vírus Sindbis (SINV), Vírus O’nyong-nyong (ONNV), os quais são responsáveis por causar surtos de poliartralgia ou poliartrite muitas vezes crônicas e debilitantes. O MAYV é responsável por surtos esporádicos de doença febril aguda em comunidades rurais de países da América do Sul. A febre Mayaro é uma doença autolimitante que pode variar de leve a moderadamente severa. Os sinais clínicos incluem dor de cabeça, febre, erupção cutânea, fotofobia, mialgia e artralgia, que pode ser persistente. Os casos de febre Mayaro afetam principalmente pessoas que trabalham ou residem próximas as áreas de florestas, pois o MAYV é um patógeno zoonótico, mantido na natureza em ciclos silvestres e rurais. Esses ciclos envolvem o mosquito Haemogogus janthinomys como vetor e vertebrados como hospedeiros. No Brasil os casos de febre Mayaro são comumente relatados em áreas rurais das Regiões Norte e Centro Oeste do país, embora, casos recentes têm sido descritos em áreas urbanas de Manaus e Mato Grosso. Esses relatos destacam a preocupação com o potencial de emergência e urbanização do MAYV no Brasil e outros países, uma vez que a artrite e miosite induzidas pelo MAYV podem ser debilitantes e com considerável impacto na qualidade de vida das pessoas sendo, além disso, pouco compreendida. Por isso, o objetivo deste trabalho foi estabelecer um modelo animal para estudo da patogênese induzida pelo MAYV. No experimento foram utilizados camundongos Balb/c com 15 dias de idade, os quais foram infectados por duas vias distintas: abaixo do membro torácico e na almofada da pata do membro pélvico. Os animais foram avaliados em intervalos de 24 horas por 21 dias, para aparecimento de sinais clínicos, quanto ao ganho de peso, e perda de forca pelo teste físico Wire-hang. Também foram realizadas analises histológicas do músculo e articulação do tornozelo. A resposta imune foi acessada pela quantificação de citocinas no soro e tecido por citometria de fluxo, e além disso também foi realizado o teste de dor. Os resultados demonstraram que o MAYV induziu doença aguda nos animais, os quais apresentaram piloereção, postura encurvada, irritação no olho e leve alteração da marcha. No teste físico ambos os grupos tiveram perda de resistência, o que estava associado aos danos histopatológicos, que incluiu miosite, artrite, tenossinovite e periostite. A resposta imune foi caracterizada por uma forte resposta inflamatória mediada pelas citocinas TNF-α, IL-6 e INF-γ e quimiocina MCP-1, seguida pela ação das citocinas IL-10 e IL-4. Portanto, os camundongos Balb/c representam um modelo promissor para estudo dos mecanismos envolvidos na patogênese, resposta imune e futuramente como plataformas para testes de antivirais e vacinas.Item Clonagem, avaliação de SNPs e expressão heteróloga da ATP Difosfohidrolase 2 (NTPDase 2) das cepas ET e NSL de Leishmania (Viannia) braziliensis(Universidade Federal de Viçosa, 2017-07-24) Torres, Nancy da Rocha; Fietto, Juliana Lopes Rangel; http://lattes.cnpq.br/6343881665000925As leishmanioses compreendem um conjunto de doenças causadas por protozoários do gênero Leishmania e transmitidas pela picada de fêmeas de insetos flebotomíneos. Apresentam diferentes formas de manifestações clínicas de acordo com a espécie envolvida, podendo apresentar sintomatologia mais severa correlacionada à infecção por cepas mais virulentas. Estudos indicam que L. braziliensis, principal agente da leishmaniose cutânea e mucocutânea no Brasil, possui uma diversidade intra-espécie e que diferentes cepas estão relacionadas a diferenças na virulência, podendo influenciar o desenvolvimento de diferentes formas clínicas. Foi observado que as cepas ET e NSL apresentam características polares quanto à virulência e infecciosidade em modelo murino. Além disso, foi observado que essas cepas diferem na hidrólise de nucleotídeos extracelulares e que a alta taxa de hidrólise de ATP se correlaciona com a cepa NSL, de maior virulência. O mesmo trabalho identificou a presença de SNPs não silenciosos na sequência da NTPDase2 de NSL, mas nenhuma correlação com a atividade de hidrólise de nucleotídeos, virulência e infectividade foi observada. Considerando papel das NTPDases de Leishmania na hidrólise de nucleotídeos extracelulares e na modulação da resposta imune do hospedeiro, o objetivo desse trabalho consistiu em investigar a relação desses polimorfismos com a atividade da enzima NTPDase2, visando compreender as diferenças de hidrólise de nucleotídeos e virulência previamente observados. Nesse trabalho, a região que codifica para o ectodomínio da enzima NTPDase2 das cepas ET e NSL foi isolado e clonado em vetor bacteriano e a sequência correspondente ao ectodomínio de ET/NSL-NTPDase2 foi clonada no vetor pET21b, expressa e purificada. Análises de polimorfismos nas sequências indicam que os clones ET apresentam apenas SNPs silenciosos nas posições 861 e 879. Diferentemente, alguns clones NSL apresentam sequência idêntica à de ET e outros possuem SNPs nas posições 213, 296, 377, 554 e 1126, mudando os aminoácidos nas posições 99, 126, 185 e 376. Avaliando a estrutura 3D das proteínas, foi observado que a maioria das mutações são externas à enzima e que a mutação T376A se localiza em uma região predita como importante para a ligação ao substrato. Juntos, esses resultados levantam questões importantes acerca da influência desses SNPs na estrutura e atividade da enzima, que podem nortear experimentos futuros, a fim de elucidar o papel de variantes genéticas para a enzima NTPDase2 nos fenômenos observados para essas duas cepas em L. braziliensis.