Production, characterization and evaluation of the chemotherapeutic and immunogenic potential of protein based virus-like particles in tumoral and immune cell lines

Abstract

In this thesis, nanotechnology was used to develop three inedited platforms with clinical applications. Results are presented in three chapters written in article format. In the first chapter, in vitro assays are used to characterize a new doxorubicin (DOX) carrier virus-like platform and to evaluate the cell effects of murine melanoma cells treated with free DOX or carried DOX. It is showed that carried DOX promotes higher cell death rates and enter cells in a different manner whether compared with free DOX. In the second chapter, the Spy Catcher/Spy Tag technology was used to conjugate different peptides to rod-shaped virus-like particles (VLPs). It is shown that two different types of antigen-presenting cells (APCs) can take up decorated VLPs and this promotes the activation of immune response by increasing CD80 and CD86 expression. In the third chapter, Spy Catcher/Spy Tag technology was also used to conjugate anti-EGFR nanobodies to the surface of DOX-loaded VLPs. It is shown that particles displaying anti-EGFR nanobodies promote a more accentuated decrease on cell viability of human colorectal cancer cells whether compared with non-decorated particles. In conclusion, this work present the full production and characterization of three distinct nanoplatforms and a solid in vitro evaluation of a range of cell mechanisms such as endocytosis, apoptosis and autophagy. The achieved results suggest that the constructions presented here have features that put them as nanoplatforms with potential clinical applications such as vaccine platforms and drug delivery systems. Keywords: Nanotechnology. Drug-delivery systems. Vaccine platforms. Protein-based particles. Nucleic acid-based particles. Particle decoration. Doxorubicin. Cancer.Nesta tese, a nanotecnologia foi utilizada para desenvolver três plataformas inéditas com aplicações clínicas. Os resultados são apresentados em três capítulos escritos em formato de artigo. No primeiro capítulo, ensaios in vitro são usados para caracterizar uma nova plataforma virus-like carreadora de doxorrubicina (DOX) e para avaliar os efeitos celulares em células de melanoma murino tratadas com DOX livre ou com DOX carreada. É demonstrado que a DOX carreada promove maiores taxas de morte celular bem como entra nas células de maneira diferente se comparada à DOX livre. No segundo capítulo, a tecnologia Spy Catcher/Spy Tag foi usada para conjugar diferentes peptídeos a partículas virus-like (VLPs) cilíndricas. É demonstrado que dois tipos diferentes de células apresentadoras de antígenos (APCs) conseguem interiorizar VLPs decoradas e isso promove a ativação da resposta imune através do aumento da expressão de CD80 e CD86. No terceiro capítulo, a tecnologia Spy Catcher/Spy Tag também foi usada para conjugar nanocorpos anti-EGFR à superfície de VLPs carreadoras de DOX. É demonstrado que partículas apresentando nanocorpos anti-EGFR promovem uma diminuição mais acentuada na viabilidade celular de células de câncer colorretal humano quando comparadas com partículas não decoradas. Concluindo, este trabalho apresenta a completa produção e caracterização de três nanoplataformas distintas e uma criteriosa avaliação in vitro de uma série de mecanismos celulares como endocitose, apoptose e autofagia. Os resultados alcançados sugerem que as construções aqui apresentadas possuem características que as colocam como nanoplataformas com aplicações clínicas em potencial, como plataformas de vacinas e sistemas de entrega de medicamentos. Palavras chave: Nanotecnologia. Sistemas de entrega de medicamentos. Plataformas vacinais. Partículas proteicas. Partículas de ácidos nucleicos. Decoração de partículas. Doxorrubicina. Câncer.