Clonagem, avaliação de SNPs e expressão heteróloga da ATP Difosfohidrolase 2 (NTPDase 2) das cepas ET e NSL de Leishmania (Viannia) braziliensis

Abstract

As leishmanioses compreendem um conjunto de doenças causadas por protozoários do gênero Leishmania e transmitidas pela picada de fêmeas de insetos flebotomíneos. Apresentam diferentes formas de manifestações clínicas de acordo com a espécie envolvida, podendo apresentar sintomatologia mais severa correlacionada à infecção por cepas mais virulentas. Estudos indicam que L. braziliensis, principal agente da leishmaniose cutânea e mucocutânea no Brasil, possui uma diversidade intra-espécie e que diferentes cepas estão relacionadas a diferenças na virulência, podendo influenciar o desenvolvimento de diferentes formas clínicas. Foi observado que as cepas ET e NSL apresentam características polares quanto à virulência e infecciosidade em modelo murino. Além disso, foi observado que essas cepas diferem na hidrólise de nucleotídeos extracelulares e que a alta taxa de hidrólise de ATP se correlaciona com a cepa NSL, de maior virulência. O mesmo trabalho identificou a presença de SNPs não silenciosos na sequência da NTPDase2 de NSL, mas nenhuma correlação com a atividade de hidrólise de nucleotídeos, virulência e infectividade foi observada. Considerando papel das NTPDases de Leishmania na hidrólise de nucleotídeos extracelulares e na modulação da resposta imune do hospedeiro, o objetivo desse trabalho consistiu em investigar a relação desses polimorfismos com a atividade da enzima NTPDase2, visando compreender as diferenças de hidrólise de nucleotídeos e virulência previamente observados. Nesse trabalho, a região que codifica para o ectodomínio da enzima NTPDase2 das cepas ET e NSL foi isolado e clonado em vetor bacteriano e a sequência correspondente ao ectodomínio de ET/NSL-NTPDase2 foi clonada no vetor pET21b, expressa e purificada. Análises de polimorfismos nas sequências indicam que os clones ET apresentam apenas SNPs silenciosos nas posições 861 e 879. Diferentemente, alguns clones NSL apresentam sequência idêntica à de ET e outros possuem SNPs nas posições 213, 296, 377, 554 e 1126, mudando os aminoácidos nas posições 99, 126, 185 e 376. Avaliando a estrutura 3D das proteínas, foi observado que a maioria das mutações são externas à enzima e que a mutação T376A se localiza em uma região predita como importante para a ligação ao substrato. Juntos, esses resultados levantam questões importantes acerca da influência desses SNPs na estrutura e atividade da enzima, que podem nortear experimentos futuros, a fim de elucidar o papel de variantes genéticas para a enzima NTPDase2 nos fenômenos observados para essas duas cepas em L. braziliensis.

Leishmaniasis comprises a set of diseases caused by Leishmania protozoa and transmitted by the bite of females of phlebotomine insects. They present different clinical outcomes according to the species and may present more severe symptomatology correlated to infection by more virulent strains. Studies indicate that L. braziliensis, the main agent of cutaneous and mucocutaneous leishmaniasis in Brazil, has an intra-species diversity and different strains are related to differences in virulence, who affects the development of different clinical forms. It was observed that the ET and NSL strains have polar characteristics regarding virulence and infectivity in murine model. Furthermore, it was observed that these strains differ in hydrolysis of extracellular nucleotides and the high rate of hydrolysis of ATP correlates with the NSL, the higher virulence strain. The same work identified non-silent SNPs in NTPDase2 sequence, but no correlation with nucleotide hydrolysis activity, virulence and infectivity was observed. Considering the role of Leishmania NTPDases in hydrolysis of extracellular nucleotides and modulation of the host immune response, the aim of this work was to investigate the relationship of these polymorphisms with the activity of the enzyme NTPDase2, in order to understand the differences of nucleotide hydrolysis and virulence previously observed. In this work, the coding region corresponding to ectodomain NTPDase2 from ET and NSL strains was isolated and cloned into a bacterial vector and the sequence corresponding to the ET / NSL-NTPDase2 ectodomain expressed and purified. Analysis of polymorphisms in the sequences indicates that all ET clones present only silent SNPs at positions 861 and 879. In contrast, some NSL clones have a sequence identical to ET and others have SNPs at positions 213, 296, 377, 554 and 1126, changing amino acids at positions 99, 126, 185 and 376. The 3D structure of the proteins, show that most mutations are external to the enzyme and the T376A mutation is located in a predicted region as important for substrate binding. Together, these results raise important questions about the influence of these SNPs on the structure and activity of the enzyme that can guide future experiments in order to elucidate the role of genetic variants for the enzyme NTPDase2 in the phenomena observed for these two strains in L. braziliensis.