Use of flow cytometry to quantify intracellular Leishmania sp.

Abstract

The search for new methodologies that make the work in the search for new drugs more precise, agile, and with greater standardization is very important to the study of leishmaniasis. The technique most used to assess the leishmanicidal effect of a given drug in vitro, the slide count, despite being consolidated in the scientific environment, presents several difficulties in its execution, assessment, and results. In addition to being laborious, this technique takes time, both for the preparation of the material for analysis and for the counting itself. Based on this need, our research group proposes a new methodology based on nuclear labeling, using propidium iodide and flow cytometry to quantify the parasite load of Leishmania sp. in macrophages in vitro. Our results show that the fluorescence of infected samples increases as the infection rate increases. Using Pearson's Correlation analysis, it was possible to establish a correlation coefficient (Pearson r = 0.9473) that was positive, linear, and directly proportional to the variables fluorescence and infection rate. Thus, it is possible to infer a mathematical equation, through linear regression, to obtain an estimate of the number of parasites in each sample through the Relative Fluorescence Units (RFU) values. This new methodology opens space for the possibility of using this methodological resource in the in vitro quantification of Leishmania sp. in macrophages. Keywords: Flow cytometry. Leishmaniasis. Propidium iodide.

Uso da citometria de fluxo para quantificação de Leishmania sp. intracelular. Orientador: Eduardo de Almeida Marques da Silva. Investir em novas metodologias de pesquisa que tornem o trabalho na busca por novas drogas mais preciso, ágil e com maior padronização é muito importante para o estudo da leishmaniose. A técnica mais utilizada para avaliação do efeito leishmanicida de uma determinada droga in vitro, a contagem de lâminas, apesar de consolidada no meio científico, apresenta inúmeras dificuldades em sua execução, avaliação e obtenção de resultados. Além de trabalhosa, esta técnica demanda tempo, tanto para a preparação do material para análise quanto para a própria contagem. Partindo desta necessidade, nosso grupo de pesquisa propõe uma nova metodologia baseada na marcação nuclear, utilizando iodeto de propídeo e citometria de fluxo para quantificação de carga parasitária de Leishmania sp. em macrófagos in vitro. Nossos resultados mostram que a fluorescência de amostras infectadas aumenta à medida que aumenta a taxa de infecção. Pelo uso de análise de Correlação de Pearson, foi possível estabelecer um coeficiente de correlação (Pearson r = 0,9473) positivo, linear e diretamente proporcional entre as variáveis fluorescência e taxa de infecção. Assim, foi possível inferir uma equação matemática, por meio de regressão linear, para se obter a estimativa do número de parasitos de uma dada amostra por meio de valores de Unidades de Fluorescência Relativa (RFU). Essa nova metodologia abre espaço para a possibilidade de uso desse recurso metodológico na quantificação in vitro de Leishmania sp. em macrófagos. Palavras–chave: Citometria de fluxo. Leishmanioses. Iodeto de Propídeo.