RNAi em Colletotrichum lindemuthianum: caracterização das proteínas-chave e desafios para a aplicação

Abstract

O agente etiológico da antracnose, uma das principais doenças do feijão-comum (Phaseolus vulgaris L.), é o fungo Colletotrichum lindemuthianum. Devido à alta variabilidade genética do patógeno e as limitações das estratégias convencionais de controle, como o uso de cultivares resistentes e fungicidas, torna-se necessário o desenvolvimento de novas abordagens eficientes e sustentáveis. Neste contexto, o RNA de interferência (RNAi) surge como uma alternativa promissora, permitindo o silenciamento de genes essenciais para a patogenicidade do fungo. Com isso, o presente estudo teve como objetivos: caracterizar os principais componentes da maquinaria de RNAi em C. lindemuthianum; avaliar a expressão dos genes-chave durante a interação com o feijão-comum; investigar a capacidade do fungo de captar dsRNAs exógenos; e silenciar genes-alvo quando aplicados por pulverização (SIGS). A análise do genoma de C. lindemuthianum permitiu identificar proteínas- chave da maquinaria de RNAi, incluindo duas Argonautas (AGO), duas Dicer-like (DCL) e três RNA polimerases dependentes de RNA (RdRPs). Dentre essas, ClAGO2, ClRdRP2 e ClRdRP3 foram descritas pela primeira vez na espécie. Todas as proteínas apresentaram domínios altamente conservados, e a análise filogenética indica que os genes que as codificam foram mantidos nos genomas, com maior proximidade entre espécies do mesmo complexo taxonômico do gênero Colletotrichum. A expressão dos genes AGO1, RdRP3 e DCL1 do fungo na interação com a planta variou ao longo do tempo e da linhagem avaliada. Foram obtidos 18 e 180 transformantes de C. lindemuthianum e C. truncatum, respectivamente, expressando GFP. A produção de dsRNAs apresentou baixo rendimento em dois métodos testados (in vivo e in vitro), resultando em uma média de 12,2 µg de dsRNA sintetizado pelo kit comercial. Os ensaios de captação de dsRNA por microcultivo indicaram que C. lindemuthianum é capaz de perceber dsRNAs exógenos, com aumento no número e tamanho de vacúolos, porém os resultados foram inconclusivos quanto a absorção. A pulverização dos dsRNAs direcionados a ClSGE1 (regulador transcricional putativo) e ClpacC (regulador transcricional em resposta ao pH) a 4 ng.µL-1 não foram capazes de controlar a antracnose no feijão-comum nas condições avaliadas. Dessa forma, foi possível caracterizar as proteínas envolvidas no mecanismo de RNAi e demonstrar que C. lindemuthianum é capaz de perceber dsRNAs exógenos, abrindo caminho para futuros testes de captação. Além disso, este estudo contribui para a compreensão dos desafios associados a padronização e o uso de dsRNA como estratégia de controle de fitopatógenos e inicia as investigações desse método para C. lindemuthianum. Palavras-chave: RNAi; Antracnose; Feijão-comum; SIGS.The etiological agent of anthracnose, one of the main diseases affecting common bean (Phaseolus vulgaris L.), is the fungus Colletotrichum lindemuthianum. Due to the high genetic variability of the pathogen and the limitations of conventional control strategies, such as the use of resistant cultivars and fungicides, the development of new, efficient, and sustainable approaches is necessary. In this context, RNA interference (RNAi) emerges as a promising alternative, enabling the silencing of essential genes for fungal pathogenicity. Thus, the present study aimed to: characterize the main components of the RNAi machinery in C. lindemuthianum; evaluate the expression of key genes during its interaction with common bean; investigate the fungus's ability to uptake exogenous dsRNAs; and silence target genes through spray-induced gene silencing (SIGS). The genomic analysis of C. lindemuthianum identified key proteins of the RNAi machinery, including two Argonaute (AGO) proteins, two Dicer-like (DCL) proteins, and three RNA-dependent RNA polymerases (RdRPs). Among these, ClAGO2, ClRdRP2, and ClRdRP3 were described for the first time in this species. All proteins exhibited highly conserved domains, and phylogenetic analysis indicates that the genes encoding them have been retained in the genomes, showing greater phylogenetic proximity among species within the same taxonomic complex of the genus Colletotrichum. The expression of fungal genes AGO1, RdRP3, and DCL1 during plant interaction varied over time and among the evaluated lineages. A total of 18 and 180 transformants expressing GFP were obtained for C. lindemuthianum and C. truncatum, respectively. The dsRNA production yield was low using both tested methods (in vivo and in vitro), resulting in an average of 12.2 µg of dsRNA synthesized using the commercial kit. The dsRNA uptake assays in microcultures indicated that C. lindemuthianum can detect exogenous dsRNAs, showing an increase in the number and size of vacuoles. However, the results were inconclusive regarding dsRNA absorption. Spraying dsRNAs targeting ClSGE1 (putative transcriptional regulator) and ClpacC (pH-responsive transcriptional regulator) at 4 ng.µL?¹ failed to control anthracnose in common bean under the evaluated conditions. Thus, this study successfully characterized the proteins involved in the RNAi mechanism and demonstrated that C. lindemuthianum can perceive exogenous dsRNAs, paving the way forfuture uptake assays. Additionally, it contributes to the understanding of the challenges associated with standardizing and using dsRNA as a strategy for phytopathogen control and initiates investigations into this method for C. lindemuthianum. Keywords: RNAi; Anthracnose; Common bean; SIG.