Caracterização funcional do efetor Phapa-4574965 de Phakopsora pachyrhizi na interação com Glycine max

Abstract

Uma das principais doenças que afeta a cultura da soja no Brasil é a Ferrugem Asiática da Soja (ASR – Asian Soybean Rust). Quando em alta severidade, essa doença, causada pelo fungo biotrófico obrigatório Phakopsora pachyrhizi, pode causar perdas de produtividade de até 90%. Muitas são as estratégias existentes para o manejo da doença, desde o uso de fungicidas, de variedades contendo genes de resistência, até o vazio sanitário e o emprego de cultivares precoces. No entanto, com o uso intensivo de fungicidas e cultivares resistentes aliados à elevada variabilidade genética e eficiente adaptação do patógeno, tais medidas perdem eficácia ou não são capazes de controlar as variantes do fungo. Com o intuito de encontrar novas metodologias duradouras e sustentáveis para incrementar o manejo da ASR, pesquisas têm concentrado na interação planta-patógeno, visando compreender os componentes e mecanismos envolvidos no ataque do patógeno, defesa do hospedeiro e suas interações. No caso das plantas, seu sistema imune inato pode ser dividido em duas linhas de defesa. A primeira (Imunidade Desencadeada por PAMPs - PTI) é ativada com o reconhecimento de padrões moleculares associados à patógenos (PAMPs) liberados pelos microrganismos e patógenos. Em contrapartida, os patógenos se adaptam para suprimir as respostas de defesa associadas PTI e favorecer a infecção por meio da secreção de proteínas efetoras. Quando o hospedeiro possui proteínas R capazes de reconhecer esses efetores, consegue elevar sua amplitude de defesa e reduzir a infecção por meio de sua segunda linha de defesa (Imunidade Desencadeada por Efetores - ETI), que se sustenta até a presença de outra proteína efetora irreconhecível pela proteína R atual, caracterizando a co-evolução entre patógeno e hospedeiro. Frente ao exposto, as proteínas efetoras possuem grande influência no sucesso da infecção e desenvolvimento dos fitopatógenos. Deste modo, esta tese visa caracterizar funcionalmente a proteína efetora Phapa-4574965 de P. pachyrhizi e suas interações com as células hospedeiras, buscando identificar seus possíveis interactores na soja. Foram empregadas metodologias para o estudo da interação proteína-proteína como os ensaios “Pull-down” e Y2H, análise do seu perfil de expressão durante a infecção por qPCR, e de sua localização subcelular em células vegetal por meio de co-expressão transiente e imunolocalização, analisados em microscopia confocal. O gene Phapa-4574965 expressou- se significativamente nos tempos 12, 24 e 48 horas após a inoculação do patógeno. Possíveis interações foram observadas entre Phapa-4574965 e proteínas de soja atuantes tanto de forma direta no sistema de defesa da planta quanto através da produção e metabolismosenergéticos, com destaque nas proteínas “Alanine Transaminase”, “NAD-dependent epimerase/dehydratase domain-containing protein”, “Cysteine Proteinase” e “Aminomethyltransferase”. Phapa-4574965 apresentou localização nuclear e citoplasmática em células de N. benthamiana, além de mitocondrial, que se correlaciona com a “Aminomethyltransferase” da soja e a predição de localização de Phapa-4574965. Os resultados gerados pelo presente estudo fornecem informações adicionais para auxiliar futuros estudos para enriquecer a compreensão da interação soja-P. pachyrhizi e elaborar de novas estratégias que facilitem o manejo de ASR. Palavras-chave: Ferrugem asiática da soja, efetor fitopatogênico, interação soja- P. pachyrhizi.One of the main diseases that affects soybean crop in Brazil is Asian Soybean Rust (ASR – Asian Soybean Rust). When in high severity, this disease, caused by the obligate biotrophic fungus Phakopsora pachyrhizi, can cause yield losses of up to 90%. There are many strategies to control the disease, from the use of fungicides, varieties containing resistance genes, to sanitary void and the use of early cultivars. However, with the intensive use of fungicides and resistant cultivars combined with the high genetic variability and efficient adaptation of the pathogen, such methods lose effectiveness or are not capable to control fungal variants. To find new lasting and sustainable methodologies to improve the management of ASR, research has focused on plant-pathogen interaction, aiming to understand the components and mechanisms involved in pathogen attack, host defense and their interactions. In the case of plants, their innate immune system can be divided into two defense lines. The first (PAMP- Triggered Immunity - PTI) is activated with the recognition of pathogen-associated molecular patterns (PAMPs) released by microorganisms and pathogens. In contrast, pathogens are adapted to suppress PTI-associated defense responses and favor infection through the secretion of effector proteins. When the host has R proteins capable to recognize these effectors, it can increase its defense amplitude and reduce infection through its second defense line (Effector-Triggered Immunity - ETI), which is sustained until the presence of another unrecognizable effector protein by the current R protein, characterizing the co- evolution between pathogen and host. In view of the above, effector proteins have a great influence on the infection success and phytopathogens development. Therefore, this study aims to functionally characterize the effector protein Phapa-4574965 of P. pachyrhizi and their interactions with host cells, seeking to identify their possible interactors in soybeans. Methodologies were used to study protein-protein interaction, such as the Pull-down and Y2H assays, expression profile analysis during infection by qPCR, and its subcellular localization in plant cells through transient co-expression and immunolocalization analyzed using confocal microscopy. The Phapa-4574965 gene was significantly expressed at 12, 24 and 48 hours after pathogen inoculation. Possible interactions were observed between Phapa-4574965 and soybean proteins acting both directly in the plant's defense system and through energy production and metabolism, with emphasis on the proteins Alanine Transaminase, NAD-dependent epimerase/dehydratase domain-containing protein, Cysteine Proteinase and Aminomethyltransferase. Phapa-4574965 showed nuclear and cytoplasmic localization in N. benthamiana cells, in addition to mitochondrial, which correlates with the soybean’ “Aminomethyltransferase” and the localization prediction of Phapa-4574965. The results generated by the present study provide additional information to assist future studies to enrich the understanding of the soybean-P. pachyrhizi interaction and develop new strategies that facilitate the management of ASR. Keywords: Asian soybean rust, phytopathogenic effector, soybean-P. pachyrhizi interaction.