Caracterização de vesículas extracelulares produzidas por Actinobacillus pleuropneumoniae em resposta a diferentes condições de estresse

Abstract

A família Pasteurellaceae engloba diversas espécies de bactérias Gram-negativas, algumas das quais são patogênicas para humanos e animais de produção. Membros dessa família são responsáveis por doenças que causam impacto econômico significativo na indústria suinícola, resultando em desafios consideráveis e altos custos associados ao uso de antimicrobianos. Essas bactérias frequentemente manifestam resistência a múltiplas drogas, o que dificulta ainda mais o tratamento. Entre as principais enfermidades na cadeia suinícola, a pleuropneumonia suína (PPS) destaca-se como uma das mais comuns. Actinobacillus pleuropneumoniae (App) é uma bactéria Gram-negativa, anaeróbia facultativa, pertencente à família Pasteurellaceae, sendo o agente etiológico da pleuropneumonia suína. Esta bactéria possui diversos fatores de virulência, como cápsula, lipopolissacarídeo (LPS), produção de sideróforos para captação de ferro e toxinas Apx. Além disso, é capaz de produzir vesículas extracelulares (VEs). Estudos anteriores destacaram a importância das VEs como um fator de virulência para App, mas ainda faltam informações sobre as condições que induzem a produção de VEs, bem como a transferência de material genético carregado por essas vesículas. Portanto, os objetivos deste trabalho foram investigar a vesiculação por A. pleuropneumoniae MV780, sorotipo 8, sob diferentes condições de estresse, e determinar se as VEs produzidas transportam material genético, um novo mecanismo de transferência horizontal de genes para App. As VEs de App foram obtidas em diferentes fases do crescimento bacteriano e em diferentes condições de estresse: por privação de ferro e na presença de antimicrobianos no meio de cultivo. Posteriormente, foram realizados testes de vesidução para verificar a capacidade de transferência de material genético por VEs de App. As vesículas foram investigadas quanto ao tamanho e dispersão, morfologia, conteúdo proteico e quantificação. Por fim, realizamos análises moleculares para detecção de marcadores moleculares que indicam a presença do plasmídeo p780 nas VEs produzidas e o possível potencial de transferência para outros isolados de App por vesidução. Nossos resultados indicaram que as vesículas produzidas por App não apresentam diferenças significativas quanto à morfologia; porém, tamanho e dispersão variaram nas diferentes fases de crescimento e emdiferentes condições de estresse. Nossos dados indicam que tanto a fase de crescimento quanto as condições de estresse influenciam diversos aspectos da produção de VEs, incluindo quantidade e perfil proteico. Evidenciamos que App produz mais VEs em condições de estresse, independentemente das fases de crescimento. As VEs produzidas apresentam material genético intracelular protegido da ação de nucleases, e o plasmídeo p780 é empacotado por VEs nas diferentes condições estudadas. Demonstramos o potencial de transferência deste plasmídeo para outro isolado de App, comprovando assim que App possui a capacidade de transferência de material genético carreado por vesículas extracelulares. Este trabalho é pioneiro na produção e caracterização de VEs em condições de privação de ferro e na presença de agentes antimicrobianos no meio de cultivo. Além disso, demonstramos pela primeira vez para a espécie a transferência de material genético por vesidução em App. Palavras-chave: Pasteurellaceae. Actinobacillus pleuropneumoniae. Vesículas Extracelulares. Vesiculação. VesiduçãoThe Pasteurellaceae family encompasses various Gram-negative bacteria, some of which are pathogenic to humans and production animals. Members of this family are responsible for diseases that have a significant economic impact on the swine industry, leading to considerable challenges and high costs associated with the use of antimicrobials. These bacteria often exhibit resistance to multiple drugs, further complicating treatment. Among the primary diseases in the swine industry, swine pleuropneumonia (SPP) stands out as one of the most common. Actinobacillus pleuropneumoniae (App) is a Gram-negative, facultative anaerobic bacterium belonging to the Pasteurellaceae family, serving as the etiological agent of swine pleuropneumonia. This bacterium possesses various virulence factors, such as a capsule, lipopolysaccharide (LPS), siderophore production for iron uptake, and Apx toxins. Additionally, it is capable of producing extracellular vesicles (EVs). Previous studies have emphasized the importance of EVs as a virulence factor for App, but information is still lacking regarding the conditions that induce EV production and the transfer of genetic material carried by these vesicles. Therefore, the objectives of this study were to investigate vesiculation by A. pleuropneumoniae MV780, serotype 8, under different stress conditions and determine if the produced EVs transport genetic material, representing a novel mechanism for horizontal gene transfer in App. EVs from App were obtained at different bacterial growth phases and under various stress conditions, including iron deprivation and the presence of antimicrobials in the culture medium. Subsequently, vesiculation tests were conducted to verify the capacity for genetic material transfer by App EVs. The vesicles were examined for size and dispersion, morphology, protein content, and quantification. Finally, molecular analyses were performed to detect molecular markers indicating the presence of the p780 plasmid in the produced EVs and the potential for transfer to other App isolates through vesiculation. Our results indicated that vesicles produced by App showed no significant differences in morphology, but size and dispersion varied in different growth phases and under different stress conditions. Our data suggest that both the growth phase and stress conditions influence various aspects of EVproduction, including quantity and protein profile. We demonstrated that App produces more EVs under stress conditions, regardless of growth phases. The produced EVs contain intracellular genetic material protected from nuclease action, and the p780 plasmid is packaged by EVs under the studied conditions. We showcased the potential transfer of this plasmid to another App isolate, confirming that App has the capability to transfer genetic material via extracellular vesicles. This study is pioneering in the production and characterization of EVs under iron deprivation and the presence of antimicrobial agents in the culture medium. Additionally, we demonstrated, for the first time in the species, the transfer of genetic material through vesiculation in App. Keywords: Pasteurellaceae. Actinobacillus pleuropneumoniae. Extracellular Vesicles. Vesiculation. Vesiduction