Listeria monocytogenes: Caracterização da ilha de patogenicidade-3 e expressão de llsX em condições de estresse

Abstract

Listeria monocytogenes é um patógeno de origem alimentar que devido ao seu caráter ubíquo representa um importante problema a saúde pública. L. monocytogenes pode ser classificado em quatro diferentes linhagens evolutivas (I, II, III e IV), e em termos de doença sabe-se que a maior parte dos casos clínicos de listeriose estão associados ao sorotipo 4b, pertencente a linhagem I. A presença da Ilha de Patogenicidade 3 (LIPI-3) de L. monocytogenes pode ser associada a maior virulência desses isolados, pois esta ilha codifica a Listeriolisina S (LLS), um fator de virulência necessário para a sobrevivência do patógeno in vivo. A LIPI-3 tem sido identificada predominantemente em cepas da linhagem I de L. monocytogenes, demonstrando a heterogeneidade da distribuição dos fatores de virulência nos diferentes sorotipos desse patógeno. Por esta razão o objetivo deste trabalho foi realizar pesquisa de genes da LIPI-3 em cepas de L. monocytogenes, por meio de análises comparativas entre as cepas positivas e testes fenotípicos para a expressão da LIPI-3 in vitro em diferentes condições de estresse ácido. Homólogos dos oito genes da LIPI-3 (llsAGHXBYDP) foram identificados em 43% dos 35 isolados pesquisados, sendo presente apenas nos isolados da linhagem I de L. monocytogenes. Dentre os isolados LIPI-3 positivos, foi possível observar menor polimorfismo de nucleotídeo único (SNP) e mutações nos isolados ST1 (4b) e ST3 (1/2b), quando comparados com os isolados ST218 (4b) e ST 288 (1/2b). Essa menor variabilidade genética da LIPI-3 em cepas provenientes de isolados clínicos (4b), quando comparada com isolados provenientes de alimentos (1/2b), destaca a importância da LIPI-3 como fator de virulência. O gene llsX é altamente conservado entre os diferentes STs estudados e pode ser utilizado como marcador na identificação de LIPI-3 em L. monocytogenes. No entanto, a variação de (SNPs) entre os isolados dos diferentes sorotipos demonstrou a alteração do peptídeo final obtido de LLS nos isolados ST218 (4b) e 288 (1/2b), o que pode resultar em menor potencial de virulência destas cepas. Sendo assim, a identificação do gene llsX em L. monocytogenes não pode ser relacionada a maior virulência dos isolados, o que destaca a importância da pesquisa genotípica no estabelecimento da epidemiologia correta de listeriose. Com base nos resultados obtidos na etapa de pesquisa da LIPI-3 em L. monocytogenes, três isolados distintos foram selecionados para a avaliação da expressão do gene llsX in vitro sob diferentes condições de estresse ácido; os resultados obtidos nesta etapa revelam diferenças significativas na expressão do gene llsX. Embora a expressão tenha sido observada para os dois sorotipos pesquisados (4b e 1/2a), a expressão de llsX após seis horas de estresse ácido só foi observada no isolado 4b, destacando a importância desse sorotipo e sua maior virulência associada em L. monocytogenes. Com o advento das novas técnicas de sequenciamento genético é possível realizar análises comparativas mais fidedignas e uma melhor classificação dos diferentes sorotipos de L. monocytogenes. O estudo da variação genética pode levar a uma melhor compreensão da heterogeneidade no perfil de virulência entre os isolados de L. monocytogenes pertencentes ao mesmo sorotipo, assim como a um melhor entendimento da função de LLS como fator de virulência.Listeria monocytogenes is a foodborne pathogen and due to its ubiquitous characteristic represents an important public health concern. L. monocytogenes can be categorized into four different evolutionary lineages (I, II, III and IV); in terms of disease it is known that most clinical cases of listeriosis are associated with serotype 4b, lineage I. The presence of L. monocytogenes Pathogenicity Island 3 (LIPI-3) is associated with a higher virulence in some strains, since this island encodes for Listeriolysin S (LLS), a virulence factor necessary for the survival of the pathogen in vivo. LIPI-3 has been identified predominantly in lineage I of L. monocytogenes, highlighting the heterogeneity in the virulence among the different L. monocytogenes serotypes. Thus, the main purpose of this study was to research LIPI-3 genes in L. monocytogenes strains, to carry out comparative analysis between LIPI-3 positive strains, in association with phenotypic tests for LIPI-3 expression in vitro under different acid stress conditions. Homologues of the eight LIPI-3 genes (llsAGHXBYDP) were identified in 43% of the 35 isolates surveyed, being present only in isolates lineage I of L. monocytogenes. Among LIPI-3 positive isolates, it was possible to identify a lower single nucleotide polymorphism (SNP) and mutation profile in ST1 (4b) and ST3 (1/2b) isolates when compared to isolates ST218 (4b) and ST 288 (1/2b). The lower genetic variability of LIPI-3 in strains from clinical isolates (4b), when compared to isolates from food (1/2b), highlights the importance of LIPI-3 as a virulence factor. llsX gene was highly conserved in all isolates from different STs in this study and can be used as a marker to identify LIPI-3 in L. monocytogenes strains. However, the variation of (SNPs) between the isolates of the different serotypes revealed the alteration of the final peptide obtained (LLS) in isolates ST218 (4b) and 288 (1/2b), which may result in lower virulence potential of these strains. Thus, the identification of the llsX gene in L. monocytogenes cannot be associated to a high virulence activity or potential of the isolates. This finding highlights the importance of genetic research in establishing the correct epidemiology of listeriosis. Based on the results obtained in the LIPI- 3 screening in L. monocytogenes, three distinct isolates were selected for expression evaluation of the 11sX gene in vitro under different acid stress conditions, the results obtained in this step revealed significant differences in llsX expression, although the expression was observed for the two serotypes 4b and 1/2a, llsX expression after six hours of acid stress was only observed in isolate 4b, highlighting the importance of this serotype and its association with higher virulence in L. monocytogenes. With the advent of new genetic sequencing techniques, it is possible to carry out more reliable comparative analyzes and to have a reliable characterization of the different L. monocytogenes serotypes. The study of the genetic variation can lead to a better understanding of the heterogeneity in the virulence profile among the isolates of L. monocytogenes belonging to the same serotype, as well as a better understanding of the function of LLS as a virulence factor.