Ciências Agrárias
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Item A complexa história evolutiva de Cedrela fissilis (meliaceae) da Mata Atlântica brasileira durante as mudanças climáticas do quaternário(Universidade Federal de Viçosa, 2016-09-29) Mangaravite, Érica; Oliveira, Luiz Orlando de; http://lattes.cnpq.br/8462661253665730A floresta Atlântica brasileira, uma das regiões de maior biodiversidade no mundo, está entre as cinco áreas mais importantes, hotspot de biodiversidade, possuindo mais de 8.000 espécies endêmicas. Entretanto, ela é uma das florestas mais ameaçadas do mundo. Estudos vêm sendo conduzidos com o objetivo de tentar entender as razões que levaram a este grande acúmulo de biodiversidade. Nós estudamos o modelo de distribuição de espécies, diversidade genética e filogeografia em populações de Cedrela fissilis da floresta Atlântica, com o intuito de responder se populações estariam em refúgios secos ou em florestas úmidas durante o último máximo glacial (LGM). Nossos resultados mostraram suporte para ambas as hipóteses, sugerindo assim que provavelmente uma combinação de processos atuaram no espaço e no tempo formando a diversidade que existe atualmente. Além disso, Estudos moleculares necessitam de DNA de qualidade e, em plantas, as folhas não estão sempre disponíveis. Dessa forma, nós testamos uma completa metodologia de extração de tecido do câmbio em diferentes espécies (Anadenanthera peregrina var. peregrina, Cedrela fissilis, Ceiba speciosa e Dimorphandra wilsonii) a fim de obter um DNA adequado para amplificação. O protocolo utilizado aqui, desde a coleta até a extração, foi efetivo para a obtenção de produtos de PCR para sequenciamento e genotipagem.Item Begomovirus-host protein-protein interaction network: identifying an intracytoplasmic route for viral DNA intracelular transport(Universidade Federal de Viçosa, 2019-02-27) Mageste, Bianca Castro Gouveia; Fontes, Elizabeth Pacheco Batista; http://lattes.cnpq.br/7957229598694967Viruses are obligate intracellular parasites and, once in the host cell cytoplasm, they must move intracellularly to and from the replication site to the plasma membrane for spreading. Understanding how viruses hijack the host intracellular transport system using a limited repertoire of proteins provides an opportunity to uncover the molecular bases of the host transport machinery. Begomovirus, a plant ssDNAvirus, use two movement proteins, MP and NSP, to move intracellularly from the site of replication in the nucleus to the cell surface. However, the host components of vDNA complex competent for intracytoplasmic translocation have not been identified, and the underlying mechanism for intracytoplasmic trafficking of vDNA remains to be elucidated. Here, we used a previously fabricated, in situ synthesized protein microarray containing 4600 ORFs of Arabidopsis to identify NSP- and MPArabidopsis protein-protein interactions (PPIs). Consistent with the movement function of the viral proteins, the identified NSP-MP-PPI network uncovered direct and indirect interactions, over represented under the terms transport activity ontology, protein binding, membrane-bound organelles, intracellular vesicle, and SNARE complex, which may define an intracellular route for vDNA trafficking. These studies thus provided critical framework for future investigationsto elucidate the molecular mechanisms for intracytoplasmic transport of begomoviruses. Based on this assumption, we selected an NSP-specifically interacting syntaxin-6 domaincontaining protein, designated NISP for further characterization. We provided several lines of evidence indicating that NISP may be involved in directing the intracytoplasmic anterograde movement of NSP-vDNA. First, we used coimmunoprecipitation assays and bimolecular fluorescence complementation assay to confirm that NISP interacted with NSP in planta and showed that the complex formation occurred in trafficking vesicles likely associated to trans-Golgi network (TGN)/early endosome. Second, we showed that NISP exhibited a pro-viral function and the begomovirus infection required the NIPS-NSP interaction. The mutant nisp-1 was resistant to begomovirus as the knock lines displayed attenuated symptoms, a delayed course of infection and accumulated much lower viral DNA as compared to Col-0 and overexpressing lines. This nisp-1 resistance phenotype was reversed by NISP complementation, confirming that the nisp-1 phenotype was due to inactivation of NISP gene. In contrast, the overexpressing lines were hypersensitive to begomovirus, as they displayed an accelerated course of infection and lowered load of viral DNA as compared to Col-0. We took advantage of a highly conserved NISP paralog, AT2G18860, to show that NISP-NSP interaction underscored the molecular bases for the NISP pro-viral function. AT2G18860, which shares with NISP a 78.6% identical syntaxin-6 domain, did not interact with NSP and thusdid not interfere with begomovirus infection. Consistent with these data, NISP, but not AT2G18860, was induced by begomovirus infection. Third, NISP was also demonstrated to interact with NIG, which facilitates the release of the NSP-DNA complex from the nuclear pores to the cytosol, and the presence of NSP enhanced the NISP-NIG complex formation. We used ChIP assay to demonstrate that NISP was also associated with vDNA in infected cells, which may be assembled into a NISP-NIG-NSP multiprotein complex. Finally, the NISP interactions relocated the dispersed cytosolic NIG and viral NSP to trafficking vesicle likely associated to TGN/microsomes; thereby, favoring the interaction of NSP-DNA with MP, which has been shown to bind to microsome-associated SYTA for the MP-mediated cell-to-cell movement of vDNA.Item Caracterização molecular de alelos associados à qualidade do grão de soja(Universidade Federal de Viçosa, 2017-03-08) Silva, Luiz Cláudio Costa; Fontes, Elizabeth Pacheco Batista; http://lattes.cnpq.br/8392082540654480A soja (Glycine max (L.) Merrill) é um dos mais importantes produtos do agronegócio brasileiro, apresentando como principais atrativos seus altos teores de óleo e proteína no grão. A proteína de soja apresenta grande importância histórica na pecuária brasileira, sendo ingrediente básico da maioria das rações de suínos, aves e peixes. Atualmente, a soja também é importante fonte de proteína na alimentação humana, sendo consumida na forma de diferentes produtos, alguns dos quais têm na sacarose um importante componente. O óleo de soja, por sua vez, apresenta grande importância tanto na indústria alimentícia quanto na produção de biodiesel, uma forma de combustível biodegradável cuja utilização vem aumentando consideravelmente no país devido a leis de incentivo do Governo Federal. O Programa de Melhoramento da Qualidade da Soja (PMQS/BIOAGRO/UFV) tem como objetivo o desenvolvimento de cultivares de soja especiais, visando melhor atender ao mercado de soja para alimentação humana e para produção de óleo de qualidade. O presente trabalho insere-se dentro deste contexto e foi dividido em dois capítulos. No Capítulo I foi caracterizada uma nova mutação no gene GmFAD3A da variedade CS303TNKCA, desenvolvida pelo PMQS e que apresenta baixo teor de ácido linolênico. Esta mutação (delA) foi avaliada em uma população F 2 segregante para teor de ácido linolênico contendo 187 plantas, e em populações F 2:3 e F 2:4 , em diferentes ambientes, por meio de um marcador molecular baseado em High Resolution Melt (HRM). DelA explicou entre 48,81-65,97% da variação da característica, reduzindo os teores de ácido linolênico para 3,4-4,4%, se mostrando uma boa fonte de variabilidade genética para o desenvolvimento de cultivares de soja com óleo de maior qualidade. No Capítulo II, foi avaliado o efeito de uma mutação anteriormente caracterizada por outros pesquisadores no gene rafinose sintase 2 (GmRS2) da linhagem PI200508 sobre características de qualidade do grão de soja, pela da avaliação de uma população F 2 contendo 168 indivíduos. A mutação explicou 69,61%, 51,81% e 31,96% dos teores de estaquiose, rafinose e sacarose, respectivamente, e foi capaz de produzir soja com 0,18% de estaquiose no grão, em média. Os baixos valores de coeficiente de determinação encontrados para teor de proteína e óleo indicam que a mutação pode ser utilizada para aumentar o teor de sacarose e reduzir os teores de rafinose e estaquiose sem mudanças significativas nos teores de óleo e proteína.Item Characterization of transcriptionally active atwwp1 nuclear bodies that confer partial immunity against begomoviruses(Universidade Federal de Viçosa, 2017-02-06) Calil, Iara Pinheiro; Fontes, Elizabeth Pacheco Batista; http://lattes.cnpq.br/9424472381660293As DNA viruses, which replicate in the nucleus of infected cells, the bipartite begomoviruses (Geminiviridae family) encode the nuclear shuttle protein to facilitate the translocation of viral DNA from the nucleus to the cytoplasm via nuclear pores. This intracellular trafficking of NSP-DNA complexes is accessorized by the NSP- interacting GTPase (NIG) at the cytosolic side. Here, we report the characterization of AtWWP1, a WW domain-containing protein, identified as a NIG partner. In the chapter II, we demonstrated that AtWWP1 forms nuclear bodies (NBs) via its WW domains and relocates NIG from the cytoplasm to the nucleus where it is confined to AtWWP1-NBs.Therefore, the NIG-AtWWP1 interaction, which also occurs via the WW domains, may interfere with the NIG pro-viral function that is associated with its cytosolic localization. Consistent with this hypothesis, loss of AtWWP1 function debilitates further the plant upon begomovirus infection and overexpression of AtWWP1 confers tolerance to begomovirus. The antiviral function of AtWWP1-NBs, however, may be antagonized by viral infection, which was demonstrated to induce either a decrease in the number or disruption of AtWWP1-NBs. Our data established that AtWWP1 organizes nuclear structures as nuclear foci, which provide intrinsic immunity against begomovirus infection. Nevertheless, the underlying biochemical function of these AtWWP1-NBs has yet to be elucidated. In Chapter III, we demonstrated that AtWWP1-NB co-localizes with CDKC;2-NB, which has been shown to be involved in transcription and RNA processing. Like CDKC2, which modulates the phosphorylation status of RNA polymerase II C-terminal domain (CTD-RNA pol II), we showed that AtWWP1 interacts with CTD-RNA pol II within NBs. AtWWP1-NBs were disintegrated into diffuse pattern or converted to larger structures upon treatment with transcriptional inhibitors, a feature that resembles the CDKC2-NB dynamic organization, which depends on the transcriptional status of the cells. As further evidence for a role in transcription, we also demonstrated that AtWWP1 displays DNA binding activity and AtWWP1-NBs associate with active chromatin regions. Accordingly, the manipulation of the AtWWP1 levels promoted an enrichment of differentially expressed transcriptional factors in transgenic lines. Collectively, our data establish that the nuclear bodies formed by AtWWP1 are associated with active gene expression or co-transcriptional RNA processing.Item Da floresta para a savana e de volta para a floresta: história evolutiva do gênero Dimorphandra (Leguminosae)(Universidade Federal de Viçosa, 2019-07-23) Rocha, Vinicius Delgado; Oliveira, Luiz Orlando de; http://lattes.cnpq.br/1145432535640113Amazônia e Mata Atlântica são fitodomínios caracterizados por florestas tropicais enquanto que o Cerrado é composto por vegetação de savana. Estes três fitodomínios são encontrados na América do Sul e possuem certas afinidades na flora e fauna. Mudanças de habitat ou de fitodomínios (transições ecológicas) podem explicar a atual distribuição geográfica e a diversificação de organismos. O gênero Dimorphandra inclui 26 espécies divididas em três subgêneros: (1) Dimorphandra com ocorrência nos três fitodomínios; (2) Phaneropsia e (3) Pocillum com ocorrência restrita na Amazônia. Neste estudo, investigou-se a relações filogenéticas do gênero Dimorphandra usando dados moleculares de genoma cloroplastíco e do genoma nuclear para fazer inferências sobre a história evolutiva da flora arbórea nos fitodomínios. Os dados mostraram que as espécies do subgênero Dimorphandra do Cerrado e Mata Atlântica tiveram posição mais derivada, sugerindo evolução mais recentemente. Dimorphandra do Cerrado teve origem em ancestrais da floresta da Amazônica, enquanto que pelos menos três espécies amazônicas tiveram origem em ancestrais do Cerrado. As espécies de Dimorphandra da Mata Atlântica foram descendentes de linhagens ancestrais do Cerrado. O gênero Dimorphandra evolui sob um dinâmico processo de transição ecológica entre os três fitodomínios, havendo migração e posterior diversificação de linhagens da floresta Amazônica dentro Cerrado ou vice-versa, e do Cerrado dentro Mata Atlântica. Portanto, processos de transições ecológicas parecem ter contribuído na montagem da flora destes fitodomínios. A análise filogenética bayesiana revelou que o gênero Dimorphandra não é monofilético e de modo geral cada subgênero foi agrupado em um clado. Os subgêneros Phaneropsia e Pocillum tiveram relações filogenéticas mais próximas com outros gêneros do que com o subgênero Dimorphandra. Apesar das evidências filogenéticas sugerirem que o gênero Dimorphandra merece uma nova revisão, decidimos manter a atual circunscrição até que a posição incongruente dos subgêneros Phaneropsia e Pocillum seja resolvida. Palavras-chaves: Amazônia. Cerrado. Diversificação. Flora arbórea. Mata Atlântica. Transições ecológicas.Item Development of a new machine learning-derived method for high-throughput prediction of plant receptor-like proteins(Universidade Federal de Viçosa, 2020-02-28) Silva, José Cleydson Ferreira da; Fontes, Elizabeth Pacheco Batista; http://lattes.cnpq.br/3083063529099935Machine learning (ML) is a field of artificial intelligence that has rapidly emerged in plant molecular biology, thus allowing the exploitation of massive data. The main challenges are to analyze massive datasets and extract new knowledge of cellular systems. Here, we just presented a systematic review to disentangle ML approaches is relevant for plant scientists (Chapter 1). We presented the main steps for ML development, including data selection, features extraction, training algorithms and evaluation of classification/prediction models, indicating role ML algorithm in the post-genomic era. Additionally, based on the systematic review we also developed a framework machine learning method for cell surface receptors prediction (Chapter 2). Two classes of cell surface receptors designated receptor-like protein kinase (RLK) and receptor-like protein (RLPs) are essential for perceiving and processing external and internal signals in plants and animal. Both are involved in plant development and pathogen responses and share a similar extracellular domain, capable of initial sensing environmental signal. However, RLPs have short divergent C-terminal regions not associated with conserved kinase domain characteristic of RLKs. The absence of C-terminal phylogenetic relationships between RLK and RLPs precludes the use of sequence comparison algorithms for high-throughput predictions of the RLP family. Thus, we developed the first RLP predictor in plants designated RLPredictiOme. The RLPredictiOme was implemented based on machine learning models associated with Bayesian inference. The ML models were developed in three stages to distinguish RLPs from noRLPs, RLPs from RLKs and classify new subfamilies of RLPs in plants. The evaluation of the models resulted in a high accuracy, precision, sensitivity, and specificity and relatively high probability ranging from 0.79 to 0.99 for RLPs predictions. In addition, a complete validate the of RLPredictiOme was performed with LRR-RLPs of previously characterized Arabidopsis RLPs, Arabidopsis and rice and more than 90% of known RLPs were correctly predicted. In addition to predicting previously characterized RLPs, RLPredictiOme uncovered new RLP subfamilies in the Arabidopsis genome. These include a probable lipid transfer (PLT)-RLP, plastocyanin-like-RLP, ring finger-RLP, glycosyl-hydrolase-RLP, and glycerophosphoryl diester phosphodiesterase (GDPDL)-RLP subfamilies, yet to be characterized. In comparison with the only Arabidopsis GDPDL-RLK, molecular evolution studies confirmed that the ectodomain of GDPDL-RLPs from Arabidopsis might have undergone purifying selection with a predominance of synonymous substitutions. Expression analyses revealed that predicted GDPGL-RLPs display a basal level of expression and respond to developmental and biotic signals. The results of these biological assays substantiate the notion that the members of this subfamily have maintained functional domains during evolution and may play relevant roles in development and plant defense. Therefore, RLPredictiOme can provide new insights into the functional role of surface receptors and their relationships with different biological processes. Keywords: Machine learning. Receptor-like protein. RLPredictiOme.Item Domínios da proteína antiviral WWP1: formação de corpos nucleares e interação com proteínas pro-virais(Universidade Federal de Viçosa, 2022-08-29) Breves, Sâmera de Souza; Fontes, Elizabeth Pacheco Batista; http://lattes.cnpq.br/1522576129801988A proteína WW domain-containing protein (AtWWP1) possui 463 aminoácidos e contém dois domínios de triptofano conservados que reconhecem motivos ricos em prolina (PRM) e sítios de serina/treonina-prolina fosforilados. AtWWP1 atua como proteína antiviral promovendo a translocação da proteína pro-viral citoplasmática NSP- interacting GTPase (NIG) para corpos nucleares, diminuindo o processo infeccioso contra begomovirus. A rede de interações proteína-proteína de Arabidopsis thaliana ligada ao hub imune da proteína COP9 signalosome complex subunit 5 (CSN5A) revelou que, além de NIG, AtWWP1 também se conecta com Methyl CpG binding domain 2 protein (AtMBD2), uma proteína capaz de reconhecer regiões metiladas das ilhas CpG. A proteína formadora de corpos nucleares, designada ciclina dependente de quinase 2 (CDKC2), também foi co-localizada com AtWWP1 nos corpos nucleares. Sabendo que CDKC2 fosforila a porção C-terminal (CTD) da RNA polimerase II e AtMBD2 está associado a fatores de repressão transcricional e desmetilação do DNA, levantou-se a hipótese de que os corpos nucleares formadores de AtWWP1 são transcricionalmente ativos. Para identificar como a proteína AtWWP1 interage com as proteínas CDKC2 e AtMBD2, ensaios in vitro e in planta de proteínas mutantes e truncadas de AtWWP1 foram realizados, concluindo que AtWWP1 interage com CDKC2, em leveduras, via seus domínios de triptofano conservados e com AtMBD2 via porção C-terminal in vitro e in vivo. Estudos funcionais da proteína AtMBD2 sugerem seu envolvimento no processo de infecção contra begomovirus. Inicialmente foi demonstrado que, além de participar do hub imune de CSN5A, AtMBD2 é induzida por infecção com Cabbage leaf curl virus (CabLCV) similarmente a AtWWP1 e NIG. Além disso, foi demonstrado que a superexpressão de AtMBD2 aumentou a suscetibilidade ao vírus, enquanto inativação de AtMBD2 no nocaute mbd2 – Salk 069448 diminuiu significativamente o acúmulo do DNA viral comparado com as linhagens controle, Col-0. Estes resultados indicam que AtMBD2 participa do processo de infecção viral e exibe atividade pró-viral. Como NIG, AtMBD2 não forma corpos nucleares mas é redirecionada para corpos nucleares quando expressa com AtWWP1, confirmando a atividade imune intrínseca dos corpos nucleares derivados de AtWWP1. Palavras-Chave: Domínio WW. AtWWP1. AtMBD2. Corpos nucleares. Atividade pro-viralItem Ensaios de interação proteína-proteína revelam funções similares de proteínas em diferentes espécies de plantas e patógenos(Universidade Federal de Viçosa, 2023-06-20) Euclydes, Nívea Costa; Fontes, Elizabeth Pacheco Batista; http://lattes.cnpq.br/1014454844872741Raramente, as proteínas funcionam como formas monoméricas e, frequentemente, exercem suas funções como dímeros ou por meio de interações com outras proteínas (heterodímeros ou oligômeros). Estas interações proteína-proteína são particularmente relevantes em vias de sinalização celulares em que os sinais percebidos por receptores são propagados intracelularmente por meio de interações proteína-proteína. A via de sinalização de morte celular mediada por proteínas DCD/NRPs (“Development and Cell Death Domain-containing N-Rich Proteins”) tem sido caracterizada em soja e representa um importante circuito de sinalização que liga senescência foliar natural com aquela induzida por estresses e pode conferir às plantas tolerância à seca. Exceto por GmNAC30 cujo ortólogo de Arabidopsis ainda não foi identificado, os demais componentes da via em soja, NRP-A, NRP-B, GmNAC81, VPE possuem ortólogo caracterizados em Arabidopsis, AtNRP1, AtNRP2, ANAC36 e gamaVPE, respectivamente. GmNAC30 pertence à família SNACA, compartilhando maior grau de conservação de sequência com ATAF2 de Arabidopsis. Sendo assim, o presente estudo propôs investigar, como primeiro objetivo, a possível participação de AtATAF2 na via de morte celular programada mediada por NRPs, como o ortólogo de GmNAC30. Por meio de ensaios de duplo híbrido em leveduras e BiFC em folhas de Nicotiana benthamiana, foi demonstrado que ATAF2 interage com ANAC36 de uma forma específica e, como GmNAC30, também interage com GmNAC81. Estes resultados sugerem que ATAF2 é provavelmente o parceiro natural de ANAC36 na indução da expressão de VPE. Além disso, ATAF2 é localizado no núcleo e exibe atividade transcricional em leveduras, propriedades bioquímicas próprias de GmNAC30. Dentre os patógenos de plantas economicamente importantes, os geminivírus destacam-se por sua ampla ocorrência no mundo e pela variedade de hospedeiros. Begomovírus constitui o maior gênero da família Geminiviridae, cujas espécies são transmitidas pela mosca branca e representam uma restrição severa à agricultura globalmente. Similarmente a outros vírus, os begomovírus formam rede de interações proteína-proteína entre proteínas virais e do hospedeiro. Recentemente, foi identificado o interactoma entre proteínas virais e do hospedeiro, o qual revelou um “hub” de interação proteína-proteína enriquecidos por proteínas que respondem à auxina. Embora estes resultados sugiram que a sinalização por auxina possa ser funcionalmente relevante durante a infecção por begomovírus, é necessário que estas interações sejam comprovadas por métodos alternativos de interação proteína-proteína. Sendo assim foi selecionado um representado do hub AT4G14560 que interage com ambas as proteínas virais NSP e MP a fim de se confirmar estas interações por ensaio de duplo-híbrido em leveduras. Foi demonstrado que AT4G14560 fusionada ao domínio de ativação (AD) de GAL-4 interage com NSP fusionada ao domínio de ligação (BD) de GAL-4, promovendo autotrofia a His quando coexpressas em leveduras. Assim também BD-AT4G14560 interage com AD-MP em leveduras. As interações foram específicas já que as combinações das proteínas fusionadas com vetores vazios não promoveram autotrofia à histidina em leveduras cotransformadas. Estes resultados validam os resultados de arranjo de proteínas e confirmam o possível envolvido de auxina na infecção viral, o que deverá ser investigado posteriormente. Um hub funcional bem definido do sistema imune de plantas corresponde a interconexões convergentes para a proteína CSN5A, para a qual convergem proteínas de patógenos divergentes, como C2 de geminivírus. Este hub também é enriquecido de proteínas de defesa de plantas. Considerando que a proteína AtWWP1 possui atividade antiviral contra geminivírus, foi de interesse verificar a proteína AtWWP1 também faz parte do hub imune derivado de CSN5A. Inicialmente, por meio do sistema duplo-híbrido de leveduras, foi examinada a possível interação das proteínas CSN5A e AtWWP1. A interação entre as respectivas proteínas em leveduras foi confirmada pela ativação do gene repórter LacZ, quantificado pela atividade da enzima β-galactosidase, e autotrofia à histidina em leveduras transformadas com as combinações CSN5A-BD e AtWWP1-AD, mas não em leveduras transformadas pelas combinações com vetores vazios. Além disso, a interação entre as proteínas CSN5A e AtWWP1 foi monitorada in vivo por meio dos ensaios de co- imunoprecipitação e BiFC. Nos experimentos de Co-IP, o anticorpo anti-GFP imunoprecipitou separadamente a proteína CSN5A-GFP e GFP, sendo que a proteína AtWWP1-HA foi detectada somente no imunocomplexo de CSN5A-GFP, confirmando associação estável e específica entre as proteínas AtWWP1 e CSN5A nos extratos protéicos de folhas de N. benthamiana transformadas com as respectivas construções. Nos ensaios de BiFC, coexpressão de AtWWP1 fusionada ao C-terminal de YFP e CSN5A fusionada ao N-terminal de YFP e vice-versa, promoveu a reconstituição de fluorescência no núcleo de células de folhas de N. benthamiana, mas não os controles negativos. Coletivamente, esses resultados demonstram que CSN5A e AtWWP1 interagem in vivo no núcleo de células vegetais. Estes resultados também reforçam o argumento de que o hub imune CSN5A é funcional durante a infecção por geminivírus. Palavras-chave: interação proteína proteína; patógenos de plantas; hub imune CSN5A.Item Evolutionary history of Manihot carthagenensis (Euphorbiaceae) and allied species in eastern South America(Universidade Federal de Viçosa, 2018-06-28) Silveira, Thamyres Cardoso da; Oliveira, Luiz Orlando de; http://lattes.cnpq.br/4411732208380218Manihot Mill. (Euphorbiaceae) is a Neotropical genus with approximately 100 species. Manihot carthagenensis is a very polymorphic species and associated with dry environments, mostly the caatinga and the chaco. Currently, morphological criteria associated with geographic distribution distinguish three infraspecific taxa in M. carthagenensis: M. carthagenensis subsp. carthagenensis, M. carthagenensis subsp. glaziovii, and M. carthagenensis subsp. hahnii. Herein, we assembled multilocus datasets with DNA sequence data obtained from four nuclear genes (sts, ch_metE, g3pdh, and nia-i3) for 34 samples of the three subspecies of M. carthagenensis and 14 samples from 10 closely-related species and carried out Bayesian phylogenetic analyses. We also obtained microsatellite data from 19 representative populations sampled throughout most of the known range of M. carthagenensis to investigate genetic structure and diversity. Our phylogenetic study suggested that M. carthagenensis, as presently circumscribed, does not constitute a monophyletic clade, but represents three well-differentiated lineages: M. carthagenensis, M. glaziovii and M. hahnii. These three lineages were supported based on morphological differences, genealogical relationships, and vegetation associations. Microsatellite data suggest that M. carthagenensis consists of at least three distinct gene pools partly structured according to geography. We hyphothesized that these gene pools evolved in allopatry but remained interfertile and were able to produce hybrid zones after reconnecting. Thereby the genetic admixture is of recent origin and owing to population expansion.Item Evolutionary history of the necrosis- and ethylene-inducing like protein superfamily across the Dothideomycetes (Ascomycota)(Universidade Federal de Viçosa, 2021-06-25) Dal’Sasso, Thaís Carolina da Silva; Oliveira, Luiz Orlando de; http://lattes.cnpq.br/2182540806665883Necrosis- and Ethylene-inducing peptide 1-like proteins (NLPs) form a broadly distributed superfamily involded in the early phases of plant infection and may trigger host immune responses. The majority of NLPs acts as cytotoxic proteins, inducing cell- death in eudicot plants. Dothideomycetes is a large and diverse class within the phylum Ascomycota. Corynespora cassiicola (Pleosporales) is a widespread, polyphagous plant-pathogen that causes leaf diseases on many crops. We used comparative genomic approaches and molecular phylogenetic analyses to investigate the evolutionary history of NLP across the Dothideomycetes and within C. cassiicola. Initially, we described two genomes: C. cassiicola CC_29 and C. olivacea CBS 114450. We showed that the two genome annotations differed greatly. A robust phylogenomics indicated the non-monophyly for the genus Corynespora and we suggested that the classification of C. olivacea into that genus should be revised. Subsequently, we investigate the evolution of NLPs across the Dothideomycetes. We accessed genomic resources from 33 species (five orders) with different lifestyles. The imbalanced phylogenies of NLPs suggested NLP subfamilies underwent independent evolutionary paths in the Dothideomycetes, each of which showing different signatures of ancient gene duplications and biased successive gene losses that may be associated with changes in cytotoxic activity. Subsequently, we accessed genomic resources from 44 isolates of C. cassiicola and the expression profiles of NLP- encoding genes of C. cassiicola CC_29 at the early hours of host colonization. Three NLP effector-encoding genes were maintained in the genomes of C. cassiicola and have evolved under different selective constraints. Despite highly divergent, NLP effectors maintained conserved the residues necessary to trigger plant immune responses. Nevertheless, gene expression profiles suggested that only one NLP effector gene is highly expressed at the early hours of soybean colonization by C. cassiicola. Keywords: Effector. Evolution. Phylogenomics. Comparative genomics. Corynespora cassiicola.Item Filogeografia molecular de Corynespora cassiicola, um fungo polífago e causador da mancha alvo(Universidade Federal de Viçosa, 2017-02-23) Dal’Sasso, Thaís Carolina da Silva; Oliveira, Luiz Orlando de; http://lattes.cnpq.br/2182540806665883O fungo fitopatogênico Corynespora cassiicola (Berk. & M. A. Curtis) C. T. Wei é uma espécie cosmopolita com relatos de ocorrência em folhas, hastes e raízes em diversas espécies de plantas, sendo frequentemente associada como agente causal da mancha alvo em diferentes espécies de importância agronômica. Este estudo analisou uma coleção de 32 isolados de C. cassiicola, obtidos de diferentes hospedeiros e locais no Brasil. Sete genes nucleares e um gene mitocondrial foram parcialmente sequenciados e analisados de modo a explorar as relações filogenéticas e filogeográficas entre os isolados e verificar se existe associação entre o gene precursor da toxina produzida pelo fungo, a cassiicolina, e as linhagens encontradas. Adicionalmente, a presença de mutações pontuais independentes – E198A, F200Y e G143A – que conferem resistência a fungicidas foram investigadas. Os isolados se agruparam em três linhagens. A distribuição dos isolados entre as linhagens não esteve associada a hospedeiro ou origem geográfica dos isolados. Isolados da coleção contêm uma de quatro possíveis isoformas da cassiicolina. Em geral, associação entre as isoformas e clados filogenéticos foi ausente. As três mutações pontuais que conferem resistência a fungicidas estão presentes (sozinhas ou combinadas) em oito isolados. Duas dessas mutações (E198A e F200Y) nunca haviam sido identificadas em isolados de C. cassiicola. As evidências de variabilidade genética entre os isolados e a ocorrência de três mutações pontuais independentes, em conjunto com o hábito polífago de C. cassiicola, comprometem as atuais práticas de manejo da doença na agricultura brasileira. As informações obtidas neste estudo poderão ser úteis em análises ecológicas e epidemiológicas de C. cassiicola, bem como no desenvolvimento de medidas de manejo da mancha alvo.Item Functional modulators of the pro-begomoviral protein NIG (NSP-Interacting GTPase)(Universidade Federal de Viçosa, 2021-11-18) Raimundo, Gabriel Angelo Saraiva; Fontes, Elizabeth Pacheco Batista; http://lattes.cnpq.br/5975168814090492The Begomovirus (Geminiviridae family) genome codes for multifunctional proteins responsible for viral replication, viral transport, subverting, and co-opting host functions to favor viral infections. The movement protein NSP (Nuclear Shuttle Protein) binds and escorts vDNA from the nucleus to the cytosol. The Arabidopsis thaliana cytosolic protein NIG (NSP-Interacting GTPase) accessorizes NSP transport from the nucleus to the cytosol. Accordingly, the overexpression of NIG confers enhanced susceptibility to begomovirus, thus placing NIG as a potential pro-begomoviral protein. Among host proteins, NIG associates with the endosomal NISP (NSP-interacting syntaxin domain- containing protein) to help NSP-vDNA traffic through the cytoplasm; and WWP1 (WW domain-containing protein 1), which entraps NIG in nuclear bodies. CSN5A (COP9 Signalosome Subunit 5a) is a potential NIG partner that has been shown to redirect it to the nucleus; however, NIG-CSN5A dynamic has not been elucidated. Since NIG partners influence its nuclear import, we examined whether some physiological stimulus could affect NIG localization. A phytohormone screening by confocal microscopy showed that salicylic acid (SA) could redirect NIG to the nucleus. Nuclear fractionation assays also indicated that SA could alter NIG localization to the nucleus. A WWP1 Knockout line overexpressing NIG displayed the same confocal and nuclear fractionation pattern, indicating that SA-mediated transport was independent of WWP1-mediated nuclear import of NIG. Additionally, SA promoted NIG ubiquitination and degradation, a process prevented by the proteasome inhibitor MG132. To elucidate the underlying mechanism for the proteasome-mediated degradation of NIG, the interaction between NIG and CSN5A was further investigated. CSN5A negatively regulated NIG turnover and interacted with NIG in vivo by co-immunoprecipitation assays. In the absence of stimuli, the NIG-CSN5A complex was predominantly formed in the cytosol, as shown by the BiFC (Bimolecular Fluorescence Complementation) system, yet several lines of evidence were provided indicating that SA-mediated degradation of NIG may occur in the nucleus. First, SA mediated the nuclear relocalization and degradation of NIG. Second, treatment with MG132 increased the SA-induced nuclear pool of NIG but did not alter the cytosolic levels of the protein. Finally, NIG formed a complex with CSN5A that participates in the proteolytic activity of the COP9 signalosome in the nucleus. To approach NIG role via reverse genetics, an NIG knockout line and independent complemented lines were obtained. Col-0, NIG knockout line, and NIG complemented lines were infected with the begomovirus CabLCV (Cabbage Leaf Curl Virus) through biolistics, but these genotypes did not display differences in resistance parameters against the begomovirus. These results complement the current knowledge on NIG functional modulators in the context of begomovirus infections, which may further elucidate the dynamic regarding this GTPase pro-begomoviral function. Keywords: Begomovirus. NIG. NSP.Item Germination in vitro, genetic diversity and mating system of Cedrela fissilis Vell, in central Brazil(Universidade Federal de Viçosa, 2018-02-27) Diaz-Soto, Juan Manuel; Oliveira, Luiz Orlando de; http://lattes.cnpq.br/7428554252179805In northern Minas Gerais state, there is an ecotone formed by the junction of three vegetation formations, Atlantic dry forest, Cerrado, and Caatinga. This region is threatened by over-logging and habitat destruction. Several tropical tree species native to this ecotone are endangered by extinction, subject to overexploitation and habitat loss. Cedrela fissilis is a tropical tree species native to Brazil and distributed in seasonal forests and gallery forests of northern Minas Gerais. In this study, we analyzed the genealogical placement of a population from northern Minas Gerais (PAN) related to the two known lineages (East and West) of C. fissilis and carry out genetic structure and mating system analyses of its offspring. To obtain tissue from seedling suitable for DNA extraction we tested three disinfection methods, four culture media and a commercial substrate for plants. The results showed that the application of in- vitro techniques jointly with disinfection increased the germination by a factor from 3 to 5 with respect to the non-use of in-vitro techniques, and the double disinfection increased the germination by a factor of 1.7 respect of the simple disinfection. We found high values of genetic diversity that differentiate from both the East and West lineages; thus, PAN can be considered as a new source of variability within C. fissilis. The results confirmed that C. fissilis is as an outcrossed species with some proportion of selfing. PAN presented mating among relatives, and population structure among offspring as a consequence of deviations from random mating. We concluded that restrictions to gene-flow among reproductive trees lead to the high levels of genetic differentiation observed in PAN.Item GmNAC081: elemento de convergência para comunicação cruzada entre senescência e tolerância à seca(Universidade Federal de Viçosa, 2017-07-20) Ferreira, Dalton de Oliveira; Fontes, Elizabeth Pacheco Batista; http://lattes.cnpq.br/2084370509667094O setor da agroindústria representa a maior fração das divisas na economia brasileira. No entanto, as culturas agronômicas estão sujeitas aos estresses do meio ambiente, incluindo os estresses bióticos (causados por microrganismos, herbívoros ou vírus) e abióticos (disponibilidade de água, nutrientes, presença de agentes estressantes no solo, etc) e eventos de desenvolvimento, como a senescência. No caso de defesa a estresses múltiplos, as plantas ativam uma via de sinalização de morte celular programada (PCD, programmed cell death) mediada pelos fatores de transcrição GmNAC081 e GmNAC030 que pertencem a uma grande família de transfatores específicos de plantas. Foi observado que GmNAC081 está envolvido com o processo de senescência natural e seu silenciamento retarda a senescência foliar e atenua os demais sintomas decorrentes da morte celular programada; porém, o mecanismo bioquímico envolvido não foi totalmente elucidado. Nesta investigação, foi explorada uma abordagem de genômica funcional para avaliar o mecanismo pelo qual GmNAC081 está envolvido em senescência, bem como o efeito da expressão ectópica de GmNAC081 durante o déficit hídrico. As linhagens transgênicas superexpressando o gene GmNAC081 senesceram mais rápido do que as plantas não transformadas. Nas linhagens transgênicas, GmNAC081-1, e GmNAC081-3, a expressão ectópica de GmNAC081 acelerou o amarelecimento foliar que foi associado com maior acúmulo de espécies reativas de oxigênio (ROS), comparado com as plantas controles. Enquanto que no estádio V3 (20 dias após germinação), nas linhagens transgênicas, o nível de transcritos de GmNAC081 foi muito superior àqueles de plantas não transformadas BR16, no estádio R7 (80 DAG), a expressão de GmNAC081 endógeno, em BR16, foi induzida pelo processo de senescência, alcançando níveis similares àqueles das linhagens transgênicas. A indução natural de GmNAC081 durante senescência mimetizou o fenótipo da superexpressão do transgene, uma vez que, em clusterização, as sequências expressas durante senescência natural em BR16 agruparam junto com as sequências expressas da linhagem GmNAC081-3 nas plantas em R7. Em contraste, nas plantas em V3, na linhagem transgênica, 1849 e 2813 genes foram induzidos e reprimidos, respectivamente, dos quais 455 genes regulados positivamente e 1200 genes regulados negativamente foram comum ao processo de senescência natural de folhas. Estes resultados indicam que GmNAC081 tem um papel predominante como regulador positivo de senescência foliar natural. Entre os genes regulados positivamente destacam-se alvos diretos de GmNAC081, validando os resultados de RNA-seq. Além disso, foram selecionados adicionais genes candidatos com o potencial de serem modulados por GmNAC081, como JMT, MLO3, NRT1.5, KIN10, KIT1 e SPI, os quais contem sítios de ligação para o gene GmNAC081 nos seus promotores. Estes resultados ampliaram a atividade transcricional de GmNAC081 em escala genômica, identificando um conjunto de possíveis alvos diretos que atuam para estabelecimento do processo de senescência. Também foi avaliado o efeito da superexpressão do gene GmNAC081 em resposta ao déficit hídrico. As plantas superexpressando GmNAC081 foram mais sensitivas ao déficit hídrico, apresentando menor teor de água e menor potencial hídrico, sob o mesmo regime de déficit hídrico, que as plantas não transformadas, o que foi associado com um fenótipo de senescência acelerada induzida por seca. Além disso, os parâmetros fisiológicos de trocas gasosas e de fluorescência monitorados durante o déficit demostraram a maior sensitividade das plantas transgênicas à seca. Coletivamene, os resultados dessa investigação descreveram a atividade transcricional de GmNAC081 em escala genômica e demonstraram que GmNAC081 exerce uma função positiva predominante no estabelecimento de senescência natural e regula negativamente a tolerância de plantas à seca.Item Identificação de fatores transcricionais que controlam a expressão do gene sbMATE(Universidade Federal de Viçosa, 2016-02-24) Martins, Laura Gonçalves Costa; Fontes, Elizabeth Pacheco Batista; http://lattes.cnpq.br/7369606408386792O gene SbMATE, que confere tolerância a alumínio em sorgo, é altamente expresso no ápice da radícula e codifica um transportador de membrana pertencente à família MATE (multi drug and toxic compound extrusion family) que é responsável pelo efluxo de citrato ativado por alumínio. A identificação de elementos cis-regulatórios no promotor do gene SbMATE que confere tolerância ao alumínio e de fatores transcricionais que controlam a expressão do referido gene constituem etapas fundamentais para o entendimento do mecanismo de resistência a Al mediado por SbMATE. O objetivo do presente trabalho foi a identificação e caracterização de fatores transcricionais que interagem de uma maneira específica com o promotor para controlar a expressão do gene SbMATE. Entre 22 possíveis fatores transcricionais mapeados em um eQTL que influencia a expressão de SbMATE, quatro deles, NF-YB-Like (Sorbic.009g166200), WRKY-like (Sorbic.009g174300), ZincFinger-like (Sorbic.009g151400) e SORBIDRAFT_09g022540, foram selecionados para análise de atividade de regulação de transcrição específica de promotores. Ensaios de mono-híbrido em leveduras demonstraram que a proteína WRKY41-like, mas não NFY-like, interage com o promotor SbMATE isolado tanto de linhagens tolerantes quanto de susceptíveis. A interação ocorre na região proximal (posição -2102 ao ATG) comum a todos os promotores SbMATE testados. Estes resultados foram confirmados em ensaios de transativação de promotores fusionados a GUS em protoplastos de Arabidopsis. Para isso, Arabidopis thaliana ecotipo Col-0 foi inicialmente transformada com construções de DNA, contendo a região proximal ou de fragmentos truncados do promotor SbMATE fusionados à GUS. As folhas das linhagens transgênicas foram utilizadas para o preparo de protoplastos para expressão transiente dos quatro transfatores selecionados. Tanto WRKY-like quanto ZincFinger-like transativaram especificamente o promotor de SbMATE, enquanto que NF-YB-like e SORBIDRAFT_09g022540 não foram capazes de ativar a expressão do gene repórter. Por meio de ensaios de deleção do promotor, os sítios de interação de WRKY-like e ZincFinger- like foram mapeados em um domínio cis-regulatório de 127 pb, delimitado pelas posições -2102 a -1975 no promotor SbMATE. Coletivamente, estes resultados indicam que os transfatores WRKY-like e ZincFinger-like estão envolvidos no controle da expressão do gene SbMATE.Item Mecanismos de resistência contra geminiviroses e o potencial do mutante duplo de NIK1, NIK1-T469A/T474D, em conferir resistência em tomateiros(Universidade Federal de Viçosa, 2019-07-31) Loriato, Virgilio Adriano Pereira; Fontes, Elizabeth Pacheco Batista; http://lattes.cnpq.br/4655674526261584A família Geminiviridae é uma das maiores e mais bem-sucedidas famílias de vírus de plantas que infecta uma grande variedade de culturas agronomicamente importantes, tanto dicotiledóneas quanto monocotiledóneas, e causa perdas significativas de produtividade mundialmente. Este amplo espectro de gama de hospedeiros só é possível porque os geminivírus desenvolveram estratégias sofisticadas para superar o arsenal de defesas antivirais em espécies vegetais tão diversas. Além disso, os geminivírus evoluem rapidamente através de recombinação ou pseudo-recombinação para criar naturalmente uma grande diversidade de espécies de vírus com sequências de genoma divergentes, dando ao vírus uma vantagem sobre o sistema de reconhecimento do hospedeiro. Portanto, não é surpreendente que estratégias moleculares eficientes para combater a infecção por geminivírus, em condições de campo aberto, não tenham sido totalmente desenvolvidas e abordadas experimentalmente. No primeiro capítulo, foi discutido o arsenal anti-geminiviral das defesas de plantas, as estratégias de virulência evoluídas dos geminivírus para superar essas defesas de plantas e as estratégias mais recentes que foram projetadas para resistência transgênica. No segundo capítulo, foi determinado experimentalmente a eficiência da resistência contra begomovírus que infectam tomateiros, derivada da manipulação in vitro da atividade da sinalização antiviral mediada por NIK1 [“nuclear shuttle protein (NSP)-Interacting Kinase 1]. Epidemias associadas a begomovírus atualmente ameaçam a produção mundial de tomate devido ao surgimento de espécies de vírus altamente patogênicas. Mais de dez espécies diferentes de begomovírus que infectam tomateiros foram identificadas e caracterizadas em território brasileiro na última década. A sinalização antiviral mediada por NIK1 é ativada pela infecção viral e protege as plantas contra begomovírus em interações incompatíveis, mas é superada pelo supressor viral NSP de NIK1, em interações compatíveis. A fosforilação em Thr-474 é o evento crucial que desencadeia a ativação de NIK1. A construção de um mutante de ganho de função, substituindo o resíduo Thr-474 pelo resíduo fosfomimético Asp, aumentou a resistência contra begomovírus em linhagens de tomateiro transgênico. Para gerar uma estratégia de resistência eficiente contra begomovírus, uma segunda mutação em T474D foi introduzida pela substituindo do resíduo Thr-469 por Ala e, assim, eliminando o efeito antagonista da fosforilação em Thr-469. O mutante duplo ivT469A/474D apresentou maior atividade de fosforilação in vitro em comparação com NIK1 e T474D. Os ensaios funcionais foram realizados usando linhagens de tomate transgênico transformadas com uma construção de DNA expressando T469A / T474D fusionado a GFP sob o controle do promotor 35S. As mutações duplas em NIK1 promoveram a ativação constitutiva das defesas mediadas por NIK1, mesmo em baixos níveis de expressão do transgene, resultando na repressão dos genes da proteína ribossomais, marcadores moleculares da ativação da sinalização antiviral. Além disso, as linhagens transgênicas apresentaram resistência aumentada ao begomovírus Tomato yellow spot virus (ToYSV), um fenótipo associado à ausência de sintomas, baixa eficiência da taxa de infecção e reduzido acúmulo de DNA viral nas folhas sistêmicas. Estes resultados confirmam o efeito antagonista da fosforilação em Thr-469 e Thr-474 na ativação da sinalização antiviral mediada por NIK1, indicando que, provavelmente, a fosforilação em Thr-469 regula negativamente a ativação de NIK1 para prevenir a autoimunidade.Item Molecular evolution of two pathogenicity-associated gene families across the Dothideomycetes class of fungi(Universidade Federal de Viçosa, 2023-07-20) Rocha, Vinicius Delgado da; Oliveira, Luiz Orlando de; http://lattes.cnpq.br/1145432535640113The Dothideomycetes class of fungi comprises over 19,000 described species, which are distributed into 23 orders. Generally, Dothideomycetes species have a cosmopolitan distribution and exhibit high ecological diversity, with distinct trophic modes (saprotrophic, pathogenic, endophytic, and mycorrhizal). Within the Dothideomycetes, one notable feature is the presence of many plant-pathogenic species, such as Corynespora cassiicola (Pleosporales) that causes diseases in economically important crops. Using data genomic data from 79 Dothideomycetes species (15 orders) and 61 C. cassiicola isolates, we investigated the evolutionary history of two pathogenicity-associated gene families: Pectin methylesterase (PME) and Deuterolysin metalloprotease (M35). We conducted phylogenic reconstructions and gene genealogies to uncover evolutionary patterns in both PME and M35. In C. cassiicola (isolate CC_29), we assessed gene expression patterns of members of each family, PME and M35, during the process of soybean infection. For the PME family, we recovered three major clades across the Dothideomycetes. Among these three clades, two (PME1 and PME2) have experienced duplications and sequent gene retention events, whereas the other clade (PME3) likely has evolved through biased gene loss. Each C. cassiicola isolate displayed five PME genes. The five PME haplogroups in C. cassiicola showed varying levels of genetic diversity and may have undergone distinct selective pressures. For the M35 family, the number of genes varied from zero to seven per genome across the Dothideomycetes. Specifically, some species within the order Botryophaeriales exhibited a higher numbergenesM35 genes. The majority of C. cassiicola isolates display three M35 genes per genome. In C. cassiicola, either gene retention episodes or gene loss characterized each of the four sub-clades within the M35 family. All genes of each family, PME and M35, were expressed in C. cassiicola during the interaction with soybean plants, suggesting that they are functional and may contribute to fungal infection. Keywords: Corynespora. Genomics. Gene duplication. Molecular phylogeny. Plant- pathogensItem Participação da via de sinalização mediada pela proteína DCD/NRP na morte celular em soja induzida por cádmio e infecção pelo fungo Phakopsora pachyrhizi(Universidade Federal de Viçosa, 2021-05-21) Quadros, Iana Pedro da Silva; Fontes, Elizabeth Pacheco Batista; http://lattes.cnpq.br/0759131385703220Mudanças ambientais e condições extremas, como variações de temperatura, seca e salinidade, além de estresses bióticos, afetam adversamente o crescimento das plantas e causam grande perda de produtividade para as culturas agrícolas em todo o mundo. Entretanto, as plantas desenvolveram várias estratégias para tolerar esses fatores como mecanismos sofisticados de percepção de estresses, sinalização e respostas de defesa. A via de sinalização de morte celular mediada por DCD/NRPs (Development and Cell Death Domain-containing N-Rich Proteins) tem sido caracterizada em resposta a estresses abióticos, durante senescência foliar natural e em interações incompatíveis. Estes processos biológicos resultam em morte celular programada. O objetivo dessa pesquisa foi verificar a atuação da via de sinalização mediada por DCD/NRPs em resposta ao cádmio (Cd 2+ ), que promove morte celular, e estresse biótico causado pelo fungo Phakopsora pachyrhizi. No capítulo I, foi demonstrado que Cd 2+ limita o crescimento da planta, causa intensa vermelhidão na nervura da folha, amarelecimento da folha e clorose na soja (Glycine max). Esses sintomas foram associados à morte celular programada (PCD) induzida por Cd 2+ , dado que folhas de soja estressadas por Cd 2+ exibiram número reduzido de núcleos, morte celular, dano ao DNA e atividade da caspase-1 aumentados em comparação com folhas não estressadas. Consistente com estas observações, Cd 2+ causou indução dos genes NRPs, GmNAC81, GmNAC30 e VPE, que são os componentes da sinalização de morte celular mediados por DCD/NRP, que executam PCD via atividade de caspase-1 de VPE (Vacuolar Processing Enzyme). Além disso, a superexpressão do regulador positivo desta sinalização de morte celular, GmNAC81, aumentou a sensibilidade ao estresse de Cd 2+ e intensificou as marcas de PCD mediada por Cd 2+ . A superexpressão de GmNAC81 aumentou a produção de H 2 O 2 induzida por Cd 2+ , morte celular, dano ao DNA e expressão de VPE. Por outro lado, a superexpressão de BiP, um regulador negativo do módulo de sinalização NRPs/GmNACs/VPE, conferiu tolerância ao estresse de Cd 2+ e redução da morte celular mediada por Cd 2+ . O segundo capítulo focalizou na interação entre o fungo biotrófico Phakopsora pachyrhizi e soja. Esforços de triagem em germoplasmas de sojas levaram à identificação de várias fontes de resistência a P. pachyrhizi mediada por genes Rpp. Entretanto, a caracterização dos efetores ou outros determinantes que contribuem para o reconhecimento dos isolados de P. pachyrhizi em soja não foi completamente elucidada. Neste estudo, também foi investigado se a via DCD/NRP poderia estar envolvida em interações compatíveis e incompatíveis durante a infecção com P. pachyrhizi em plantas de soja suscetíveis, BR16 e Conquista, e resistentes, BRS511 e TMG7262. Após 72 h da inoculação, a expressão dos componentes da via foi induzida nas linhagens suscetíveis BR16 e conquista e na linhagem resistente TGM7262 embora em extensões diferentes. Significantemente, a expressão dos componentes da via de morte celular em condições normais foi muito superior na linhagem resistente TGM7262, resultando em altíssima expressão de VPE, um componente importante de HR. Estes resultados sugerem que a via DCD/NRP de morte celular é ativada durante a infecção com o fungo. A fim de avaliar o envolvimento de VPE nos mecanismos de resistência, a expressão de VPE foi constitutivamente aumentada na linhagem suscetível BR16 através de superexpressão do gene GmNAC081. A superexpressão constitutiva de GmNAC081 alterou o fenótipo de suscetibilidade, sendo que as plantas transgênicas infectadas apresentaram menor número de urédias abertas e amarelecimento menos intenso das folhas ao longo da infecção, quando comparadas com BR16 não transformada. Estes resultados sugerem que a expressão aumentada de VPE pode retardar o processo de infecção pelo fungo P. pachyrhizi em soja. Entretanto, a superexpressão de um regulador negativo da via DCD/NRP, BiP, não inibiu a indução dos componentes da via DCD/NRP durante a infecção. A expressão de VPE em plantas superexpressando GmBiPD foi induzida em todos os tempos analisados após a inoculação e as plantas apresentam maior severidade de infecção, com maior número de urédias abertas e um amarelecimento acentuado do tecido. Sendo a via de sinalização de morte celular mediada por DCD/NRP induzida pelos hormônios ácido abscísico (ABA) e ácido salicílico (AS), foi também investigado o acúmulo desses hormônios em plantas infectadas. Observou-se que plantas superexpressando BiP acumularam um nível superior dos hormônios ABA e AS do que as plantas controle conquista. Provavelmente, o acúmulo acentuado de ABA e AS nas linhagens transgênicas superaram o efeito negativo de BiP na indução da via DCD/NRP. Coletivamente, estes resultados sugerem que a via de morte celular mediada por DCD/NRPs integra uma resposta coordenada a diversos sinais de estresses, portanto, sua manipulação possui o potencial para melhorar a tolerância da cultura a estresses bióticos e abióticos. Palavras-chave: Sinalização celular. Proteínas ricas em asparagina. Cd. Fungo. Morte celular. Morte celular mediada por NRP. Soja. Proteína de ligação. BiP. Enzima de processamento vacuolar. VPE.Item Regulação da atividade repressora de LIMYB mediada por fosforilação sob estresses(Universidade Federal de Viçosa, 2022-02-24) Saia, Thaina Fernanda Fillietaz; Fontes, Elizabeth Pacheco Batista; http://lattes.cnpq.br/5304348069365233LIMYB (RPLIO-INTERACTING MYB DOMAIN-CONTAINING PROTEIN), uma proteina nuclear que possui dois domínios MYB/SANT-like pertencente à familia MYB, participa da via de defesa antiviral mediada por NIK1 (NUCLEAR SHUTTLE PROTEIN-INTERACTING KINASE 1) contra begomovirus. NIK 1 é ativada por meio da percepção de elicitores bióticos e abióticos. A ativação de NIK1 desencadeia uma cascata de sinalização resultando na fosforilação da proteina ribossomal L10 (RPL10) que, como consequência, direciona-se para o núcleo. No núcleo, L10 interage com LIMYB, que se liga aos promotores e reprime a expressão de genes da maquinaria de tradução e da fotossíntese. Apesar do progresso alcançado em decifrar os mecanismos de regulação da imunidade antiviral mediada por NIK 1, a regulação da atividade repressora do componente a jusante LIMYB ainda não foi determinada. Nesta investigação, foram fornecidas diversas linhas de evidência demonstrando que fosforilação de LIMYB na serma posição 157 é induzida por ativação de NIK1 ou NIK2, modulando a atividade repressora do transfator. Incialmente, foi demonstrado que a fosforilação em LIMYB é induzida pelos mesmos elicitores que ativam NIK 1, incluindo ácidos nucleicos derivados de begomovirus, a PAMP bacteriana flg22, e calor. Por sua vez, LIMYB fosforilada reprimiu a expressão de genes relacionados com a maquinaria de tradução e fotossíntese da célula. A mutação no sítio de serina 157 por alanina atenuou o nível de fosforilação do mutante, afetando a repressão dos genes alvos de LIMYB estimulada por RNA preparado de plantas infectadas por begomovirus. Além disso foi demonstrado que fosforilação de LIMYB é induzida por ativação de NIK1 ou NIK2, já que LIMYB não foi fosforilada no mutante duplo niklnik? e a expressão do mutante NIK1-T474D, constitutivamente ativado, induziu a fosforilação de LIMYB na ausência de estímulos. Coletivamente, estes resultados indicam que fosforilação de LIMYB é mediada pela via de imunidade antiviral mediada por NIK1, sendo um mecanismo dc modulação da atividade repressora do transfator. Além disso, foi demonstrado que ácido salicílico e ABA induzem a fosforilação de LIMYB e regulam negativamente os genes marcadores da via de sinalização de NIK 1. Embora ainda não avaliado, muito provavelmente, NIKI também é regulada pelos referidos hormônios, aumentando a extensão do hub de sinalização mediada por NIK1. Palavras-Chave: Fosforilação. Modificação pós traducional. Sinalização Celular. LIMYB. NIK1. Transfator.Item Regulação de genes responsivos a estresses abióticos: tolerância a alumínio em sorgo e distúrbio fisiológico em eucalipto(Universidade Federal de Viçosa, 2020-02-20) Martins, Laura Gonçalves Costa; Fontes, Elizabeth Pacheco Batista; http://lattes.cnpq.br/7369606408386792