Domínios da proteína antiviral WWP1: formação de corpos nucleares e interação com proteínas pro-virais

Abstract

A proteína WW domain-containing protein (AtWWP1) possui 463 aminoácidos e contém dois domínios de triptofano conservados que reconhecem motivos ricos em prolina (PRM) e sítios de serina/treonina-prolina fosforilados. AtWWP1 atua como proteína antiviral promovendo a translocação da proteína pro-viral citoplasmática NSP- interacting GTPase (NIG) para corpos nucleares, diminuindo o processo infeccioso contra begomovirus. A rede de interações proteína-proteína de Arabidopsis thaliana ligada ao hub imune da proteína COP9 signalosome complex subunit 5 (CSN5A) revelou que, além de NIG, AtWWP1 também se conecta com Methyl CpG binding domain 2 protein (AtMBD2), uma proteína capaz de reconhecer regiões metiladas das ilhas CpG. A proteína formadora de corpos nucleares, designada ciclina dependente de quinase 2 (CDKC2), também foi co-localizada com AtWWP1 nos corpos nucleares. Sabendo que CDKC2 fosforila a porção C-terminal (CTD) da RNA polimerase II e AtMBD2 está associado a fatores de repressão transcricional e desmetilação do DNA, levantou-se a hipótese de que os corpos nucleares formadores de AtWWP1 são transcricionalmente ativos. Para identificar como a proteína AtWWP1 interage com as proteínas CDKC2 e AtMBD2, ensaios in vitro e in planta de proteínas mutantes e truncadas de AtWWP1 foram realizados, concluindo que AtWWP1 interage com CDKC2, em leveduras, via seus domínios de triptofano conservados e com AtMBD2 via porção C-terminal in vitro e in vivo. Estudos funcionais da proteína AtMBD2 sugerem seu envolvimento no processo de infecção contra begomovirus. Inicialmente foi demonstrado que, além de participar do hub imune de CSN5A, AtMBD2 é induzida por infecção com Cabbage leaf curl virus (CabLCV) similarmente a AtWWP1 e NIG. Além disso, foi demonstrado que a superexpressão de AtMBD2 aumentou a suscetibilidade ao vírus, enquanto inativação de AtMBD2 no nocaute mbd2 – Salk 069448 diminuiu significativamente o acúmulo do DNA viral comparado com as linhagens controle, Col-0. Estes resultados indicam que AtMBD2 participa do processo de infecção viral e exibe atividade pró-viral. Como NIG, AtMBD2 não forma corpos nucleares mas é redirecionada para corpos nucleares quando expressa com AtWWP1, confirmando a atividade imune intrínseca dos corpos nucleares derivados de AtWWP1. Palavras-Chave: Domínio WW. AtWWP1. AtMBD2. Corpos nucleares. Atividade pro-viralWW domain-containing protein 1 (AtWWP1) is a well-known 463 amino acid protein formed by two conserved tryptophan domains that recognize proline-rich motifs (PRM) and phosphorylated serine/threonine-proline sites. AtWWP1 plays an antiviral role, which promotes the relocation of pro-viral cytoplasmatic protein Nuclear shuttle protein (NSP)- interacting GTPase (NIG) to nuclear bodies, decreasing the begomovirus infection process. The Arabidopsis thaliana protein-protein interactions network connected to the COP9 signalosome complex subunit 5 (CSN5A) immune hub revealed that, in addition to NIG, AtWWP1 is also connected to Methyl CpG binding domain 2 protein (AtMBD2), a protein that recognizes CpG methylated island. The nuclear body-forming cyclin-dependent kinase 2 (CDKC2) co-localizes with AtWWP1-derived nuclear bodies. CDKC2 phosphorylates the RNA polymerase II C-terminus (CTD) and AtMBD2 is associated with repressor transcription factors and DNA demethylases, raising the hypothesis that AtWWP1-derived nuclear bodies are transcriptionally active. To delimit the domains on AtWWP1 that interact with CDKC2 and AtMBD2, we performed in vitro and in planta experiments using AtWWP1 mutants and truncated AtWWP1. These results indicate that AtWWP1 interacts with CDKC2, in yeast, via the conserved tryptophan domain and AtMBD2 via the C-terminal domain of AtWWP1 in vitro and in vivo. Functional studies of AtMBD2 implicate AtWWP1 in infection by begomovirus. Firstly, AtMBD2 participates in the CSN5A-derived immune hub and is induced by Cabbage leaf curl virus (CabLCV) infection. Additionally, AtMBD2 overexpression enhanced susceptibility to the virus, whereas AtMBD2 inactivation in the mbd2 – Salk 069448 knockout line decreased significantly the viral DNA accumulation compared to the control line, Col-0. These results indicate that AtMBD2 participates in the virus infection process and displays a proviral activity. Like NIG, AtMBD2 cannot form nuclear bodies but is redirected to nuclear bodies when expressed with AtWWP1, confirming the immune intrinsic activity of the AtWWP1-derived nuclear bodies. Keywords: WW domain. AtWWP1. AtMBD2. Nuclear bodies. Pro-viral activity