Functional modulators of the pro-begomoviral protein NIG (NSP-Interacting GTPase)

Abstract

The Begomovirus (Geminiviridae family) genome codes for multifunctional proteins responsible for viral replication, viral transport, subverting, and co-opting host functions to favor viral infections. The movement protein NSP (Nuclear Shuttle Protein) binds and escorts vDNA from the nucleus to the cytosol. The Arabidopsis thaliana cytosolic protein NIG (NSP-Interacting GTPase) accessorizes NSP transport from the nucleus to the cytosol. Accordingly, the overexpression of NIG confers enhanced susceptibility to begomovirus, thus placing NIG as a potential pro-begomoviral protein. Among host proteins, NIG associates with the endosomal NISP (NSP-interacting syntaxin domain- containing protein) to help NSP-vDNA traffic through the cytoplasm; and WWP1 (WW domain-containing protein 1), which entraps NIG in nuclear bodies. CSN5A (COP9 Signalosome Subunit 5a) is a potential NIG partner that has been shown to redirect it to the nucleus; however, NIG-CSN5A dynamic has not been elucidated. Since NIG partners influence its nuclear import, we examined whether some physiological stimulus could affect NIG localization. A phytohormone screening by confocal microscopy showed that salicylic acid (SA) could redirect NIG to the nucleus. Nuclear fractionation assays also indicated that SA could alter NIG localization to the nucleus. A WWP1 Knockout line overexpressing NIG displayed the same confocal and nuclear fractionation pattern, indicating that SA-mediated transport was independent of WWP1-mediated nuclear import of NIG. Additionally, SA promoted NIG ubiquitination and degradation, a process prevented by the proteasome inhibitor MG132. To elucidate the underlying mechanism for the proteasome-mediated degradation of NIG, the interaction between NIG and CSN5A was further investigated. CSN5A negatively regulated NIG turnover and interacted with NIG in vivo by co-immunoprecipitation assays. In the absence of stimuli, the NIG-CSN5A complex was predominantly formed in the cytosol, as shown by the BiFC (Bimolecular Fluorescence Complementation) system, yet several lines of evidence were provided indicating that SA-mediated degradation of NIG may occur in the nucleus. First, SA mediated the nuclear relocalization and degradation of NIG. Second, treatment with MG132 increased the SA-induced nuclear pool of NIG but did not alter the cytosolic levels of the protein. Finally, NIG formed a complex with CSN5A that participates in the proteolytic activity of the COP9 signalosome in the nucleus. To approach NIG role via reverse genetics, an NIG knockout line and independent complemented lines were obtained. Col-0, NIG knockout line, and NIG complemented lines were infected with the begomovirus CabLCV (Cabbage Leaf Curl Virus) through biolistics, but these genotypes did not display differences in resistance parameters against the begomovirus. These results complement the current knowledge on NIG functional modulators in the context of begomovirus infections, which may further elucidate the dynamic regarding this GTPase pro-begomoviral function. Keywords: Begomovirus. NIG. NSP.O genoma de Begomovirus (família Geminiviridae) codifica proteínas multifuncionais responsáveis pela replicação viral, transporte viral e cooptação das funções do hospedeiro para favorecer as infecções virais. A proteína de movimento NSP (Nuclear Shuttle Protein) se liga ao vDNA e auxilia o seu transporte do núcleo ao citosol. A proteína NIG, de Arabidopsis thaliana, é citoplasmática e assiste o movimento de NSP do núcleo para o citosol. Além disso, a superexpressão de NIG confere maior susceptibilidade a begomovírus, o que leva NIG a ser considerada uma proteína proviral. Dentre as proteínas do hospedeiro, NIG se associa com a proteína endossomal NISP (NSP-interacting syntaxin domain-containing protein) para acessorar o tréfego de NSP-vDNA pelo citoplasma; e WWP1 (WW domain-containing protein 1), que aprisiona NIG em corpos nucleares. CSN5A (COP9 Signalosome Subunit 5A) é um parceiro potencial de NIG capaz de redirecioná-la para o núcleo; no entanto, a dinâmica NIG-CSN5A não foi completamente elucidada. Visto que os parceiros de NIG influenciam a sua importação nuclear, avaliou-se se algum estímulo fisiológico poderia afetar a localização de NIG. Um screening de estímulos de fitohormônios monitorado por microscopia confocal com fitohormônios desmonstrou que o ácido salicílico (AS) poderia redirecionar NIG para o núcleo. Ensaios de fracionamento nuclear também indicaram que o AS poderia alterar a localização de NIG para o núcleo. Um nocaute de WWP1 supexpressando NIG apresentou o mesmo de localização revelado pela microscopia confocal e fracionamento nuclear, indicando que o transporte mediado por AS é independente da importação de NIG mediado por WWP1. Adicionalmente, o AS promoveu a ubiquitinação e degradação da proteína NIG, um processo que foi impedido pelo inibidor do proteassomo MG132. Para elucidar o mecanismo de degradação de NIG mediada pelo proteassomo, a interação entre NIG e CSN5A foi investigada. CSN5A regulou negativamente a homeostase de NIG e também interagiu in vivo por ensaios de co-imunoprecipitação. Ensaios de BiFC (Bimolecular Fluorescence Complementation) demonstraram que na ausência de estímulo, o complexo NIG-CSN5A foi predominantemente formado no citosol. No entanto, diversas evidências indicaram que a degradação de NIG mediada por AS pode ocorrer no núcleo. Inicialmente, a relocalização nuclear e a degradação de NIG foram influencidas pelo AS. Além disso, o tratamento com MG132 elevou o pool nuclear da proteína NIG induzido por AS, mas não alterou os níveis citosólicos da proteína. Finalmente, NIG formou complexo com CSN5A que participa da atividade proteolítica do signalosomo COP9 no núcleo. Para abordar o papel de NIG via genética reversa, um nocaute de NIG e linhagens independentes complementadas foram obtidos. Col-0, o nocaute de NIG e as linhagens comlementadas foram infectadas com o begomovírus CabCLV (Cabbage Leaf Curl Virus) via biolística, mas estes genótipos não apresentaram diferenças fenotípicas quanto aos parâmetros de resistência a begomovírus. Estes resultados complementam o atual conhecimento acerca dos moduladores funcionais de NIG contribuindo para desvendar a dinâmica que envolve NIG e sua função proviral. Palavras-chave: Begomovirus. NIG. NSP.