Biologia Celular e Estrutural
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Item Estudo bioquímico, biológico e busca por inibidores da nucleosídeo trifosfato difosfohidrolase-2 (LicNTPDase-2) de Leishmania infantum chagasi como estratégia para o desenho racional de drogas(Universidade Federal de Viçosa, 2014-09-08) Vasconcellos, Raphael de Souza; Silva Júnior, Abelardo; http://buscatextual.cnpq.br/buscatextual/visualizacv.do?id=K4771645P8; Bressan, Gustavo Costa; http://lattes.cnpq.br/1153853218347720; Fietto, Juliana Lopes Rangel; http://buscatextual.cnpq.br/buscatextual/visualizacv.do?id=K4790238D0; http://lattes.cnpq.br/3865196131906417; Afonso, Luis Carlos Crocco; http://buscatextual.cnpq.br/buscatextual/visualizacv.do?id=K4789739U0; Leite, João Paulo Viana; http://buscatextual.cnpq.br/buscatextual/visualizacv.do?id=K4763897U8; Oliveira, Leandro Licursi de; http://lattes.cnpq.br/0578231392218162; Teixeira, Róbson Ricardo; http://buscatextual.cnpq.br/buscatextual/visualizacv.do?id=K4723796H8A leishmaniose visceral é uma doença grave, responsável por cerca de 57 mil mortes por ano em todo o mundo. Os parasitos do gênero Leishmania se mostram incapazes de sintetizar purinas, e acredita-se que as nucleotideo trifosfato difosfohidrolases (NTPDases) participem desse processo, e até mesmo o sistema imune, pela hidrólise de nucleotídeos extracelulares. Neste trabalho a NTPDase de Leishmania infantum chagasi (LicNTPDase-2) foi estudada. A enzima mostrou uma utilização de nucleotídeos tri e difosfatados na presença de cálcio ou magnésio (GTP > GDP = UDP > ADP > UTP = ATP). A enzima também mostrou-se ativa em uma ampla faixa de pH (6,0 a 9,0) e foi inibida parcialmente por ARL67156 e suramina. A análise microscópica revelou a presença da enzima na superfície celular em diversas organelas e foi capaz de diminuir a infecção em macrófagos. Também foi avaliado a importância da padronização da renaturação de enzimas purificadas a partir de corpos de inclusão. A renaturação da LicNTPDase-2 em tampão otimizado foi capaz de aumentar a atividade enzimática em até dezesseis vezes. Devido a importância do desenvolvimento de novas drogas para o tratamento da leishmaniose visceral, foi feita a busca por inibidores. Alguns compostos, como as isobenzofuranonas WLP8 e WLP9, mesmo não sendo inibidores da LicNTPDase- 2, foram capazes de diminuir a viabilidade celular dos promastigotas de L. infantum chagasi sem afetar o crescimento de macrófagos, na concentração de 75 M. Mais estudos são necessários sobre, mas os trabalhos mostram a importância da enzima para o parasito e destaca novos compostos com potenciais para fármacos.Item Expressão heteróloga e caracterização bioquímica da nucleosídeo trifosfato difosfohidrolase-2 (NTPDase-2) de Leishmania infantum chagasi(Universidade Federal de Viçosa, 2010-07-26) Vasconcellos, Raphael de Souza; Oliveira, Leandro Licursi de; http://lattes.cnpq.br/0578231392218162; Lamêgo, Márcia Rogéria de Almeida; http://buscatextual.cnpq.br/buscatextual/visualizacv.do?id=K4782197P4; Fietto, Juliana Lopes Rangel; http://buscatextual.cnpq.br/buscatextual/visualizacv.do?id=K4790238D0; http://lattes.cnpq.br/3865196131906417; Peternelli, Ethel Fernandes de Oliveira; http://buscatextual.cnpq.br/buscatextual/visualizacv.do?id=K4704048Z8; Marco, Ricardo de; http://lattes.cnpq.br/0229339143607870; Ramos, Juliana Rocha Lopes Soares; http://buscatextual.cnpq.br/buscatextual/visualizacv.do?id=K4790613J3; Silva, Eduardo de Almeida Marques da; http://lattes.cnpq.br/9196320705613169A leishmaniose visceral é uma doença grave, responsável por cerca de 57 mil mortes por ano em todo o mundo, sendo a Leishmania chagasi o agente etiológico da leishmaniose visceral no novo mundo. Os parasitos do gênero Leishmania fazem parte da família Tripanosomatidae, a qual se mostra incapaz de sintetizar purinas pela síntese de novo. Acredita-se que as nucleosídeo trifosfato difosfohidrolases (NTPDases) participem do processo de captação de purinas, parte da via de salvação realizada por esses parasitos, e até mesmo modulem as respostas do sistema imune, pela hidrólise de nucleotídeos envolvidos com a sinalização purinérgica. Neste trabalho foi realizada a expressão heteróloga em sistema pET21b(+) e caracterização enzimática de uma NTPDase mapeada no genoma da espécie Leishmania chagasi, aqui denominada de LcNTPDase-2 por existir um outro parálogo (LcNTPDase-1), mais similar à isoforma TcNTPDase-1 de Trypanosoma cruzi. A enzima recombinante LcNTPDase-2 mostrou uma preferência pelos nucleotídeos GTP, UDP e ADP quando na presença de magnésio, e foi inativa na ausência deste íon e presença do cofator cálcio. Ensaios de atividade UDPásica na dependência de pH mostraram que a faixa de pH onde a enzima possui maior atividade está entre 7,0 e 8,0. Os compostos ARL 67156, suramina, molibidato de amônio, azida sódica e gadolínio foram testados como inibidores da atividade UDPásica, apresentando uma inibição de 97% na presença de 300μM de Gadolínio e 58% com 3 μM molibidadato de amônio. Ensaios para o estudo da atividade em função da presença de monômeros ou oligômeros também foram realizados e a enzima mostrou-se mais ativa quando na forma de monômeros. Grandes agregados protéicos foram observados e não exibiram atividade enzimática, porém, após a adição de 10 mM de DTT a enzima mostrou uma recuperação pequena da atividade. Existem fortes indícios de que haja uma correlação entre essa família de proteína e a virulência de alguns parasitos, como ocorre com Toxoplasma gondii e Trypanosoma cruzi.Item Expressão heteróloga, purificação e busca de inibidores da NTPDase-1 de Trypanosoma cruzi(Universidade Federal de Viçosa, 2010-07-26) Moura, Christiane Mariotini; Oliveira, Leandro Licursi de; http://lattes.cnpq.br/0578231392218162; Lamêgo, Márcia Rogéria de Almeida; http://buscatextual.cnpq.br/buscatextual/visualizacv.do?id=K4782197P4; Fietto, Juliana Lopes Rangel; http://buscatextual.cnpq.br/buscatextual/visualizacv.do?id=K4790238D0; http://lattes.cnpq.br/4211005796669730; Marco, Ricardo de; http://lattes.cnpq.br/0229339143607870; Bressan, Gustavo Costa; http://lattes.cnpq.br/1153853218347720; Ramos, Humberto Josué de Oliveira; http://lattes.cnpq.br/4037452920080174A Doença de Chagas é uma antropozoonose causada por Trypanosoma cruzi, um protozoário flagelado da ordem Kinetoplastida. T. cruzi possui em sua superfície uma ectonucleotidase denominada NTPDase-1. As ectonucleotidases da família E-NTPDases são enzimas capazes de hidrolisar nucleotídeos tri e/ou difosfatados, que podem ser degradados a nucleosídeos por outras ectonucleotidases. Os nucleotídeos extracelulares atuam como sinalizadores em vários processos celulares, como modulação da resposta imune de hospedeiros mamíferos. A hidrólise de ATP extracelular possui papel na infectividade e virulência do T. cruzi, bem como para outros parasitos, como Leishmania, Trichomonas, Toxoplasma, Entamoeba e outros. Por isso, as NTPDases são consideradas um alvo em potencial para o desenho racional de novas drogas para uso no tratamento da doença de Chagas. Neste trabalho realizamos a purificação parcial da NTPDase-1 e produzimos anticorpos policlonais contra ela. Além disso, avaliamos a estabilidade da sua atividade com relação à temperatura e tempo de armazenamento, estado de oligomerização, padronizamos um ensaio de inibição enzimática e realizamos uma triagem de análogos sintéticos de adenina como possíveis inibidores da NTPDase-1. Foi possível observar que a temperatura de armazenamento influenciou a atividade enzimática ao longo do tempo, sendo a temperatura de 4ºC a que melhor preservou tal atividade. A amostra protéica purificada é heterogênea, apresentando oligômeros inativos e monômeros e/ou dímeros ativos. A atividade ATPásica pode ser inibida por adenina e análogos e essa inibição parece ser do tipo competitiva.Item Imunolocalização da Nucleosídeo Trifosfato Difosfohidrolase 1 (NTP Dase-1) de Trypanossoma cruzi(Universidade Federal de Viçosa, 2010-03-15) Cunha, Luana Celina Seraphim; Lamêgo, Márcia Rogéria de Almeida; http://buscatextual.cnpq.br/buscatextual/visualizacv.do?id=K4782197P4; Neves, Clóvis Andrade; http://buscatextual.cnpq.br/buscatextual/visualizacv.do?id=K4785611E1; Fietto, Juliana Lopes Rangel; http://buscatextual.cnpq.br/buscatextual/visualizacv.do?id=K4790238D0; http://lattes.cnpq.br/8697767871204451; Oliveira, Leandro Licursi de; http://lattes.cnpq.br/0578231392218162; Fernandes, José Roberto Meyer; Mallet, Jacenir Reis dos Santos; http://buscatextual.cnpq.br/buscatextual/visualizacv.do?id=K4788247Y6Trypanosoma cruzi é um protozoário flagelado da Ordem Kinetoplastida, agente etiológico da Doença de Chagas. As ecto-nucleotidases da família E-NTPDases são enzimas capazes de hidrolisar nucleotídeos tri e/ou difosfatados nos seus produtos monofosfatados. Os nucleotídeos extracelulares são conhecidos como moléculas sinalizadoras envolvidas com vários processos celulares, incluindo a sinalização purinérgica relacionada à mediação da resposta imune de mamíferos. Mecanismos envolvidos na degradação dessas moléculas são importantes na infecção por T. cruzi e outros patógenos intracelulares. A Nucleosídio Trifosfato Difosfohidrolase 1 (NTPDase- 1) de T. cruzi é uma ecto-nucleotidase da família E-NTPDase, que hidroliza nucleotídios extracelulares, apontada como molécula importante para o processo infectivo in vitro e virulência do parasito em modelo murino. O presente trabalho se propôs a avaliar a Imunolocalização da (NTPDase-1) em três formas morfológicas da cepa Y do parasito T. cruzi. Produção e purificação de anticorpos anti NTPDase-1 recombinante de T. cruzi através de cromatografia de afinidade em resina de agarose acoplada a NTPDase1 recombinante purificada. Foram utilizados nos ensaios de especificidade por Western blot e na imunolocalização por microscopia confocal: soro policlonal anti-NTPDase1 de T. cruzi, anticorpos antiNTPDase-1 purificados e um anticorpo policlonal comercial anti CD39 de humano. A especificidade dos anticorpos e soro imune foram avalidas em extrato protéico de tripomastigotas e epimastigotas da cepa Y. A imunolocalização da NTPDase-1 foi avaliada nas três formas evolutivas do parasito, epimastigotas, amastigotas e tripomastigotas. Os anticorpos purificados demonstraram especificidade contra NTPDase-1 em extrato protéico de T. cruzi, não demonstrando reconhecimento cruzado com GDPase de L. major. Anticorpo anti CD39 de humano reconhece uma possível isoforma da NTPDase-1 de 46 kDa além da NTPDase-1 de 66 kDa em extrato protéico de epimastigota. Os parasitos foram marcados pelo anticorpo anti NTPDase-1 quanto pelo anti CD39 de humano no ensaio de microscopia. A NTPDase 1 está presente nas três formas do parasito, na forma infectiva tripomastigota, na forma proliferativa amastigota, quanto na forma não infectiva epimastigota.Item NTPDase-1 de Trypanosoma cruzi: imunolocalização e estudo de seu papel nas etapas iniciais da infecção celular por formas epimastigotas(Universidade Federal de Viçosa, 2012-11-09) Trindade, Mellina Lanna; Fietto, Juliana Lopes Rangel; http://buscatextual.cnpq.br/buscatextual/visualizacv.do?id=K4790238D0; http://lattes.cnpq.br/8256364354317911; Silva, Eduardo de Almeida Marques da; http://lattes.cnpq.br/9196320705613169; Bressan, Gustavo Costa; http://lattes.cnpq.br/1153853218347720A doença de Chagas, também conhecida como a tripanossomíase americana, é uma enfermidade tropical causada pelo protozoário Trypanosoma cruzi, sendo encontrada principalmente na América Latina e acometendo atualmente cerca de 10 milhões de pessoas no mundo. Esta doença é transmitida aos seres humanos e a mais de 150 espécies de mamíferos domésticos e selvagens pelas fezes de triatomíneos infectados durante o repasto sanguíneo. A NTPDase-1 é uma ectonucleotidase caracterizada na cepa Y do T. cruzi como uma proteína presente na superfície do parasito, sendo um importante fator de virulência, infectividade e considerada um bom alvo para bloqueio da infecção. Esta enzima catalisa a hidrólise de nucleotídeos de adenosina tri e di-fosfatados, sendo provavelmente capaz de modular a sinalização purinérgica em mamíferos. O objetivo deste trabalho foi avaliar o papel da NTPDase-1 na adesão celular do parasito em célula de mamífero através de ensaios de bloqueio com anticorpo específico e competição com a proteína recombinante, além de verificar a localização da NTPDase-1 em epimastigotas por microscopia de fluorescência confocal e microscopia eletrônica. Os resultados indicam uma redução significativa na taxa de adesão de epimastigotas em células VERO, alcançando até 85% de inibição nos ensaios de competição com a proteína NTPDase 1 recombinante e até 61% de inibição na presença de anticorpos anti- NTPDase 1 purificado, comparados ao controle composto somente de células VERO e epimastigotas de T. cruzi. As imagens obtidas por microscopia confocal e imunoeletrônica revelam a expressão da proteína na superfície do parasito e próxima a base do flagelo. A descoberta de moléculas envolvidas com o processo de infecção presentes nas interações parasitohospedeiro e o conhecimento da função destas biomoléculas pode ser um bom alvo para a quimioterapia.Item Produção de hibridomas e clones produtores de anticorpos monoclonais anti- Nucleosídeo trifosfato difosfohidrolase 1 (NTPDase-1) recombinante de Trypanosoma cruzi(Universidade Federal de Viçosa, 2010-09-02) Valle, Myrian Augusta Araújo Neves do; Lamêgo, Márcia Rogéria de Almeida; http://buscatextual.cnpq.br/buscatextual/visualizacv.do?id=K4782197P4; Paula, Sérgio Oliveira de; http://buscatextual.cnpq.br/buscatextual/visualizacv.do?id=K4767540P4; Fietto, Juliana Lopes Rangel; http://buscatextual.cnpq.br/buscatextual/visualizacv.do?id=K4790238D0; http://lattes.cnpq.br/4072728777790263; Silva Júnior, Abelardo; http://buscatextual.cnpq.br/buscatextual/visualizacv.do?id=K4771645P8; Fietto, Luciano Gomes; http://buscatextual.cnpq.br/buscatextual/visualizacv.do?id=K4763824H8; Siqueira-batista, Rodrigo; http://lattes.cnpq.br/7992589011048146; Sossai, Sidimar; http://buscatextual.cnpq.br/buscatextual/visualizacv.do?id=K4777494H9O protozoário Trypanosoma cruzi, é o agente etiológico da doença de Chagas. As ecto-nucleotidases da família E-NTPDases são enzimas capazes de hidrolisar nucleotídeos tri e/ou difosfatados nos seus produtos monofosfatados. A NTPDase-1 de T. cruzi é uma proteína presente na superfície do mesmo, com possibilidade de também ser secretada para o meio extra-celular. Sua função ainda não é totalmente esclarecida, porém dados recentes sugerem fortemente sua participação na infectividade e virulência do parasito sendo considerada um bom alvo para bloqueio da infecção. Devido a dificuldade de diagnóstico na fase crônica, a morbidade causada pela doença e a deficiência do tratamento, é de extrema importância o desenvolvimento de novas e mais eficientes metodologias de diagnóstico e tratamento, sendo, neste caso os anticorpos monoclonais uma poderosa ferramenta. A proposta do presente trabalho foi a produção de anticorpos monoclonais que reconhecessem especificamente a NTPDase-1 de T. cruzi em detrimento da NTPDase-1 de Leishimania infantum chagasi. Para isso realizou-se a expressão heterologa da NTPDase-1 em sistema bacteriano (E.coli BL-21) e sua purificação por cromatografia de afinidade em coluna de níquel-agarose (Ni-NTA). Utilizou-se para as imunizações dos camundongos a proteína obtida, sendo a confirmação e titulação do soro hiperimune realizada por dot-ELISA. Linfócitos B dos camundongos imunizados foram fusionados com células de mieloma (SP2/0) para obteção dos hibridomas, sendo 47,13% de hibridomas secretores de anticorpos anti-NTPDase-1 de T. cruzi, os hibridomas foram selecionados pelo método de ELISA indireto. Após a diluição limitante, 49 clones reconheceram a NTPDase-1 recombinante de T. cruzi o que representa aproximadamente 27% de clones positivos. Além disso 10 clones reconheceram também a NTPDase-1 de Leishmania infantum chagasi. Portanto, isolamos 39 clones que reconheceram especificamente somente a NTPDase-1 recombinante de T.cruzi.