Imunolocalização da Nucleosídeo Trifosfato Difosfohidrolase 1 (NTP Dase-1) de Trypanossoma cruzi

Abstract

Trypanosoma cruzi é um protozoário flagelado da Ordem Kinetoplastida, agente etiológico da Doença de Chagas. As ecto-nucleotidases da família E-NTPDases são enzimas capazes de hidrolisar nucleotídeos tri e/ou difosfatados nos seus produtos monofosfatados. Os nucleotídeos extracelulares são conhecidos como moléculas sinalizadoras envolvidas com vários processos celulares, incluindo a sinalização purinérgica relacionada à mediação da resposta imune de mamíferos. Mecanismos envolvidos na degradação dessas moléculas são importantes na infecção por T. cruzi e outros patógenos intracelulares. A Nucleosídio Trifosfato Difosfohidrolase 1 (NTPDase- 1) de T. cruzi é uma ecto-nucleotidase da família E-NTPDase, que hidroliza nucleotídios extracelulares, apontada como molécula importante para o processo infectivo in vitro e virulência do parasito em modelo murino. O presente trabalho se propôs a avaliar a Imunolocalização da (NTPDase-1) em três formas morfológicas da cepa Y do parasito T. cruzi. Produção e purificação de anticorpos anti NTPDase-1 recombinante de T. cruzi através de cromatografia de afinidade em resina de agarose acoplada a NTPDase1 recombinante purificada. Foram utilizados nos ensaios de especificidade por Western blot e na imunolocalização por microscopia confocal: soro policlonal anti-NTPDase1 de T. cruzi, anticorpos antiNTPDase-1 purificados e um anticorpo policlonal comercial anti CD39 de humano. A especificidade dos anticorpos e soro imune foram avalidas em extrato protéico de tripomastigotas e epimastigotas da cepa Y. A imunolocalização da NTPDase-1 foi avaliada nas três formas evolutivas do parasito, epimastigotas, amastigotas e tripomastigotas. Os anticorpos purificados demonstraram especificidade contra NTPDase-1 em extrato protéico de T. cruzi, não demonstrando reconhecimento cruzado com GDPase de L. major. Anticorpo anti CD39 de humano reconhece uma possível isoforma da NTPDase-1 de 46 kDa além da NTPDase-1 de 66 kDa em extrato protéico de epimastigota. Os parasitos foram marcados pelo anticorpo anti NTPDase-1 quanto pelo anti CD39 de humano no ensaio de microscopia. A NTPDase 1 está presente nas três formas do parasito, na forma infectiva tripomastigota, na forma proliferativa amastigota, quanto na forma não infectiva epimastigota.Trypanosoma cruzi is a protozoan of the Order Kinetoplastida, etiologic agent of Chagas disease. The ecto-nucleotidases of the E-NTPDases family are enzymes able to hydrolyze nucleotide tri-and / or diphosphates in their monophosphate products. Nucleotides are known as extracellular signaling molecules involved in various cellular processes, including purinergic signaling related to the mediation of immune response in mammals. Mechanisms involved in the degradation of these molecules are important in infection by T. cruzi and other intracellular pathogens. The Nucleoside Triphosphate Difosfohidrolase 1 (NTPDase-1) of the T.cruzi is an ecto-nucleotidase of E-NTPDase family, which hydrolyzes extracellular nucleotides, and is identified as an important molecule for the infective process in vitro and virulence of the parasite in a MURINE model. This study aimed to evaluate the Immunolocalization of (NTPDase-1) in three morphological forms of the Y strain of the parasite T. cruzi. Production and purification of antibodies NTPDase-1 recombinant T. cruzi by affinity chromatography on agars resin coupled with purified recombinant NTPDase1. There had been used in specificity tests by Western blot and in immunolocalization by confocal microscopy: polyclonal anti-NTPDase1 T. cruzi serum, antiNTPDase-1 purified antibodies and a commercial polyclonal human antibody anti CD39. The specificity of the antibodies and immune serum were assessed in protein extracts of trypomastigotes and epimastigotes of strain Y. The immunolocalization of NTPDase-1 was evaluated in three developmental stages of the parasite, epimastigotes, amastigotes and trypomastigotes. The purified antibodies shown specificity against NTPDase-1 in T. cruzi protein extract, showing no crossrecognition with GDPase L. major. Human CD39 antibody recognizes a possible isoform of NTPDase-1 at 46-kDa beyond the NTPDase-1 at 66 kDa in epimastigote protein extract. Parasites were labeled by the antibody anti NTPDase 1 as by human anti CD39 from tests of microscopy. The NTPDase 1 is present in all three forms of the parasite in the infective trypomastigote form, as proliferative amastigote, and in a noninfective epimastigote.