Expressão heteróloga, purificação e busca de inibidores da NTPDase-1 de Trypanosoma cruzi

Abstract

A Doença de Chagas é uma antropozoonose causada por Trypanosoma cruzi, um protozoário flagelado da ordem Kinetoplastida. T. cruzi possui em sua superfície uma ectonucleotidase denominada NTPDase-1. As ectonucleotidases da família E-NTPDases são enzimas capazes de hidrolisar nucleotídeos tri e/ou difosfatados, que podem ser degradados a nucleosídeos por outras ectonucleotidases. Os nucleotídeos extracelulares atuam como sinalizadores em vários processos celulares, como modulação da resposta imune de hospedeiros mamíferos. A hidrólise de ATP extracelular possui papel na infectividade e virulência do T. cruzi, bem como para outros parasitos, como Leishmania, Trichomonas, Toxoplasma, Entamoeba e outros. Por isso, as NTPDases são consideradas um alvo em potencial para o desenho racional de novas drogas para uso no tratamento da doença de Chagas. Neste trabalho realizamos a purificação parcial da NTPDase-1 e produzimos anticorpos policlonais contra ela. Além disso, avaliamos a estabilidade da sua atividade com relação à temperatura e tempo de armazenamento, estado de oligomerização, padronizamos um ensaio de inibição enzimática e realizamos uma triagem de análogos sintéticos de adenina como possíveis inibidores da NTPDase-1. Foi possível observar que a temperatura de armazenamento influenciou a atividade enzimática ao longo do tempo, sendo a temperatura de 4ºC a que melhor preservou tal atividade. A amostra protéica purificada é heterogênea, apresentando oligômeros inativos e monômeros e/ou dímeros ativos. A atividade ATPásica pode ser inibida por adenina e análogos e essa inibição parece ser do tipo competitiva.The Chagas’ Disease is an antropozoonose caused by Trypanosoma cruzi, a flagellate protozoan of order Kinetoplastida. T. cruzi presents an ectonucleotidase on its surface, named NTPDase-1. The ectonucleotidases of the E-NTPDase family are enzymes capable of hydrolyse nucleotides tri and/or diphosphates that can be degraded to nucleosides by other ectonucleotidases. Extracellular nucleotides act as signaling molecules in several celullar processes, such as modulation of immune response of mammalian hosts. The ATPe hydrolysis plays a role on T. cruzi infectivity and virulence, as in other parasites such as, Leishmania, Trichomonas, Toxoplasma and Entamoeba. Therefore, NTPDases are taken as potencial targets for the rational design of new drugs for the treatment of Chagas’ disease. In this work we performed the parcial purification of TcNTPDase-1 and produced polyclonal antibodies against it. Futhermore, we evaluated the stability of its activity with respect to time and temperature of storage, standardized an inhibition assay and performed a screening of synthetic adenine analogues as potential inhibitors of NTPDase-1. It was observed that the storage temperature influenced the enzyme activity over time, and temperature of 4 º C was the most efficient to preserve this activity. The purified protein sample is heterogeneous, with inactive oligomers and active monomers and/or dimers. The ATPase activity can be inhibited by adenine and analogues and this inhibition seems to be competitive.