Genética e Melhoramento
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Item Accumulation pattern of the phytoecdysteroid 20-hydroxyecdysone in different organs of Pffafia glomerata(Universidade Federal de Viçosa, 2008-01-22) Buselli, Reginaldo Alves Festucci; Motoike, Sérgio Yoshimitsu; http://buscatextual.cnpq.br/buscatextual/visualizacv.do?id=K4728221T8; Barbosa, Luiz Claudio de Almeida; http://buscatextual.cnpq.br/buscatextual/visualizacv.do?id=K4781106J2; Otoni, Wagner Campos; http://buscatextual.cnpq.br/buscatextual/visualizacv.do?id=K4786133Y6; http://lattes.cnpq.br/8711829719442865; Damatta, Fábio Murilo; http://buscatextual.cnpq.br/buscatextual/visualizacv.do?id=K4784185Y9; Picoli, Edgard Augusto de Toledo; http://buscatextual.cnpq.br/buscatextual/visualizacv.do?id=K4768537Z5Os ecdisteróides são hormônios esteróides encontrados em insetos e plantas. Em insetos, vários processos que ocorrem durante o seu desenvolvimento são iniciados ou controlados por pulsos específicos do zooecdisteróide 20-hidroxiecdisona (20E). Em plantas, a biossíntese, a regulação e a função precisa do fitoecdisteróide 20E permanecem desconhecidas e três hipóteses sobre suas funções potenciais têm sido propostas: i) compostos fitohormonais; ii) compostos protetores contra insetos fitófagos não adaptados; e iii) fonte de fitoesteróides polihidroxilados requeridos no crescimento e proliferação celular. A 20E foi detectada nas raízes de Pfaffia glomerata, que foi selecionada para a condução de outros experimentos. Entre os 71 acessos de P. glomerata analisados, o maior acúmulo de 20E (1,48 g) foi encontrado nas raízes do acesso 13, que foi escolhido para a realização das análises de altura, massa seca, detecção, concentração e acúmulo de 20E. Durante o desenvolvimento do acesso 13, foram identificadas três fases distintas. Na primeira fase (0 60 dias), ocorreu intenso aumento da altura em combinação com um baixo acúmulo de matéria seca. Em contraste, durante a segunda fase (60 120 dias), ocorreu intenso acúmulo de matéria seca e um pequeno aumento da altura. Durante a terceira fase (120 210 dias), ocorreu acúmulo de matéria seca menos intenso em combinação com um pequeno aumento da altura. A 20E foi constantemente detectada em todos os órgãos analisados, mas sua concentração variou durante o desenvolvimento de P. glomerata. As maiores concentrações de 20E foram seqüencialmente encontradas em flores (0.8221%), raízes (0,6658%), folhas (0,6042%), e caules (0,2445%). Em contraste, as menores concentrações de 20E foram consecutivamente encontradas em caules (0,1379%), folhas (0,2118%), raízes (0,4224%), e flores (0,4731%). Enquanto os caules apresentaram as menores variações nas concentrações de 20E (0,1379% - 0,2445%), seguidos pelas raízes (0,4224% - 0,6658%) e flores (0,4731% - 0,8221%), as folhas apresentaram as maiores variações nas concentrações de 20E (0,2118% - 0,6042%). Apesar da existência de variação na porcentagem de 20E em cada órgão analisado, o seu acúmulo apresentou um padrão específico. O padrão do acúmulo de 20E revelou que este foi predominantemente acumulado nas raízes (após 60 dias), enquanto nas folhas (após 60 dias) e nos caules (após 120 dias) o conteúdo total de 20E foi mantido constante, apresentando pequena variação.Item Adaptação das metodologias de PRINS, micromanipulação e DOP-PCR para construção de sonda da região sub-centromérica do cromossomo-X(Universidade Federal de Viçosa, 2013-03-19) Passamani, Paulo Zanchetta; Paula, Sérgio Oliveira de; http://buscatextual.cnpq.br/buscatextual/visualizacv.do?id=K4767540P4; Clarindo, Wellington Ronildo; http://buscatextual.cnpq.br/buscatextual/visualizacv.do?id=K4702819H9; Carvalho, Carlos Roberto de; http://buscatextual.cnpq.br/buscatextual/visualizacv.do?id=K4780878T0; http://lattes.cnpq.br/7745351198384911; Koehler, Andréa Dias; http://lattes.cnpq.br/2563890461457295Com o advento da hibridização in situ fluorescente, a citogenética foi introduzida na era molecular, com avanços metodológicos que possibilitaram a investigação em vários níveis da ciência dos cromossomos. Destaca-se entre esses avanços a identificação de pares de cromossomos homólogos de forma inequívoca, a localização de sequências específicas, a prospecção direta de anormalidades cromossômicas, além de proporcionar informações de alta-resolução sobre a estrutura e organização dos cromossomos. Dentro das estratégias da citogenética molecular, as técnicas de microdissecção e de DOP-PCR têm sido muito utilizadas na construção de sondas cromossomo-específicas. Entretanto, a ausência de protocolos bem estabelecidos e reprodutíveis, além da necessidade de captura por micromanipulação de um número relativamente grande de cromossomos, essa técnica tem sido limitada quanto à sua aplicação mais ampla. O presente trabalho teve como objetivo padronizar uma metodologia para construção de sondas cromossomo-específicas, associando as técnicas de micromanipulação e DOP-PCR. Culturas de linfócitos humanos foram realizadas para a obtenção de lâminas contendo metáfases, tanto de origem masculina quanto feminina. A reação de amplificação in situ (PRINS) foi realizada sobre uma lâmina contendo metáfases, aplicando uma mistura de 50 μl de reação, contendo 1,0 U de Platinun® Taq DNA Polymerase High Fidelity, tampão de reação da enzima, 2 mM de MgSO4, 200 μM de dNTPs e 4 μM de primer. Em seguida, dez fragmentos de cromossomos X foram microdissectados utilizando microagulhas acopladas a um microscópio de contraste de fase e transferidos para um tubo de 0,2mL contendo proteinase K, de onde seguiu para a desproteinização a 37 ºC por 24 horas. O material foi amplificado por DOP-PCR em 15 μl de reação, e marcado com Tetramethyl-rhodamine-5-dUTP. A sonda foi desnaturada por 10 minutos a 99 ºC em 35 μL de uma mistura de hibridização contendo: 50 % Formamida, 2X SSC, 10 % Dextran Sulfato, 1 μg de Cot-1 e 200 ng da sonda marcada. Essa mistura foi aplicada na lâmina, que foi desnatura a 75 ºC por 8 minutos e depois foi submetida à hibridização a 37 ºC por 20 horas. Após a hibridização, foram realizadas as lavagens de estringência, contra-coloração com DAPI, e visualização do material em microscópio de fluorescência acoplado a um sistema de captura de imagens. Uma sonda específica para a região subcentromérica do cromossomo X foi obtida, apresentando uma marcação em metáfases de indivíduos masculinos e duas marcações em metáfases de indivíduos femininos, além de um ou dois sinais fluorescentes nos núcleos interfásicos.Item Análise da expressão gênica induzida por Phakopsora pachyrhizi em soja(Universidade Federal de Viçosa, 2007-07-26) Brito Júnior, Salvador Lima; Marcelino, Francismar Corrêa; http://buscatextual.cnpq.br/buscatextual/visualizacv.do?id=K4706159Y3; Oliveira, Aluízio Borém de; http://buscatextual.cnpq.br/buscatextual/visualizacv.do?id=K4783555Z3; http://buscatextual.cnpq.br/buscatextual/visualizacv.do?id=K4759629P6; Caixeta, Eveline Teixeira; http://buscatextual.cnpq.br/buscatextual/visualizacv.do?id=K4728636Z7; Reis, Múcio Silva; http://buscatextual.cnpq.br/buscatextual/visualizacv.do?id=K4783370J4; Sakiyama, Ney Sussumu; http://buscatextual.cnpq.br/buscatextual/visualizacv.do?id=K4781483H8Ferrugem asiática da soja, uma doença causada pelo fungo Phakopsora pachyrhizi, tem provocado sérios danos econômicos à sojicultura brasileira e mundial. A obtenção de linhagens de soja resistentes ao fungo tem sido um desafio, e atualmente as medidas de controle da doença são baseadas no manejo da cultura e aplicação de fungicidas. Com o objetivo de avançar o conhecimento sobre o mecanismo molecular de defesa da planta frente a ferrugem asiática da soja, avaliou-se, através da técnica de PCR em tempo real, a expressão de genes que supostamente estão envolvidos no mecanismo de defesa. Dois genótipos foram selecionados para a condução do experimento, PI 230970, que possui o alelo Rpp2 e desenvolve lesões do tipo RB, quando em presença de P. pachyrhizi, e Embrapa-48, suscetível, desenvolvendo lesões tipo TAN. O experimento foi conduzido em sala climatizada (Fitotron) e para a análise de expressão gênica foram extraídos RNAs de folhas da soja inoculadas com o patógeno e falso-inoculadas (água). Dentre os genes avaliados, quitinase apresentou uma expressão 117 vezes maior no genótipo resistente (PI 230970), quando comparado com o calibrador (PI 230970 falso-inoculado), atuando possivelmente como uma barreira de defesa da planta. No genótipo suscetível a expressão deste gene foi 1,75 vezes maior que o seu calibrador (Embrapa-48 falsoinoculado). Foi observada uma expressão diferencial de genes relacionados a espécies reativas de oxigênio, produção de fitoalexinas bem como genes envolvidos na liberação de elicitores. Esses genes podem estar atuando no mecanismo de defesa contra P. pachyrhizi no genótipo resistente, porem sua expressão também no genótipo suscetível pode estar relacionado a uma maior colonização do patógeno no tecido hospedeiro ou uma resposta tardia à infecção. A identificação de uma rota de defesa pode possibilitar o estudo mais aprofundado da mesma, com o objetivo de identificar genes mais específicos no processo de defesa celular e apontar novas alternativas para obtenção de cultivares resistente.Item Análises biométricas e moleculares visando o desenvolvimento de linhagens de soja com alto teor protéico e produtivas(Universidade Federal de Viçosa, 2008-07-24) Piovesan, Newton Deniz; Sediyama, Carlos Sigueyuki; http://lattes.cnpq.br/3647241087918239; Cruz, Cosme Damião; http://buscatextual.cnpq.br/buscatextual/visualizacv.do?id=K4788274A6; Moreira, Maurílio Alves; http://buscatextual.cnpq.br/buscatextual/visualizacv.do?id=K4796105P2; http://buscatextual.cnpq.br/buscatextual/visualizacv.do?id=K4728400U5; Guimarães, Cláudia Teixeira; http://buscatextual.cnpq.br/buscatextual/visualizacv.do?id=K4782346A3; Carneiro, José Eustáquio de Souza; http://buscatextual.cnpq.br/buscatextual/visualizacv.do?id=K4783648T9A melhoria do potencial produtivo das cultivares de soja é o principal objetivo de todos os programas de melhoramento genético conduzidos no país. No entanto, em alguns programas de melhoramento, o aumento do teor de proteína nos grãos vem também sendo privilegiado. Com o propósito de desenvolver variedades produtivas e com alto conteúdo de proteína, este trabalho teve como objetivos específicos: a) comparar diferentes estratégias de seleção para a predição de ganhos em produção de grãos (PROD), altura da planta na maturação (APM), número de dias para maturação (NDM), teor de proteína (PTN) e teor de óleo (OL); b) comparar diferentes critérios de seleção por meio de índices de seleção; e c) identificar marcadores SSR ligados a QTLs que contribuam para o aumento do teor de proteína em uma população de linhagens quase isogênicas (NILs). Para alcançar estes objetivos, foram utilizadas duas populações neste trabalho, a primeira chamada população de seleção foi derivada de retrocruzamento parcial envolvendo uma linhagem de alto teor protéico e uma possuindo resistência ao herbicida glifosato. Nesta população RC1F4 segregante, foram estimados os parâmetros genéticos e praticada a seleção durante três ciclos em função do ano agrícola. Na primeira etapa, utilizaram-se as seguintes estratégias: seleção entre (SE), seleção entre e dentro (SED), seleção massal (SM) e seleção combinada (SC). A herdabilidade no sentido restrito dentro apresentou reduzido valor para PROD (8,1%), comprometendo a eficiência de seleção em nível de indivíduo. Na segunda etapa, utilizaram-se 205 progênies, pré- selecionadas para PROD, na seleção simultânea de famílias para as características PROD, PTN e OL empregando os critérios de seleção baseados nos índices de Smith e Hazel (SH), Kempthorne e Nordskog (KN), Pesek e Baker (PB) e Pesek e Baker generalizado por Tai (PB-Tai). Correlações genéticas significativas só foram detectadas para PTN × OL com valor de -0,398. Foram selecionadas as 40 famílias que maximizaram os ganhos para PTN e que proporcionaram ganhos moderados em PROD e redução mínima em OL. O índice PB-Tai apresentou melhores predições, em função do objetivo proposto, com um ganho de 4,2%, 8,9% e -3,68%, enquanto a seleção direta para PTN proporcionou um ganho de 4,45%, 3,91% e -5,85% para PTN, PROD e OL, respectivamente. Na terceira etapa, procedeu-se à estimação dos parâmetros genéticos e à predição de ganhos tanto para PROD e PTN com informação de família e planta, empregando- se diferentes estratégias e critérios de seleção. Para PTN, a herdabilidade restrita entre foi de 60,7% (superior à restrita dentro que foi de 15,6%), o que revelou uma pequena superioridade dos ganhos proporcionados por estratégias que também empregam a informação do individuo. Nesta etapa, a combinação da seleção simultânea utilizando o índice clássico de Smith e Hazel com a seleção praticada entre e dentro proporcionou ganhos significativos para PTN e PROD, porém inferiores aos da segunda etapa devido à redução da variabilidade genética. O terceiro ciclo de seleção foi realizado no ano 2006/2007 em um ensaio utilizando o DBC com as 84 famílias RC1F4:6 selecionadas no primeiro e multiplicadas no segundo ciclo com o objetivo de aumentar PTN e PROD e reduzir NDM. Para este fim, utilizou-se a seleção simultânea baseada nos índices de SH, PB, KN e PB-Tai. Novamente o índice PB-Tai foi o critério de seleção mais indicado, pois proporcionou a seleção de um grupo de progênies que em média possuíam maior produtividade e menor ciclo do que a variedade comercial Monarca e outro grupo com maior PTN e menor NDM do que Monarca. Na segunda população, foi realizado um estudo de mapeamento para identificar marcadores SSR associados à QTLs que controlam o teor de proteína nos grãos de soja. Esta população chamada de população de mapeamento foi composta de 168 NILs (isolinhas na geração RC4F6) e foi obtida a partir de retrocruzamentos entre o genótipo com alto teor protéico BARC-8 com a variedade recorrente Monarca. De um total de 350 primers de microssatélites utilizados nos progenitores, apenas 20 foram polimórficos na população de NILs. Utilizando-se a análise de associação pelo método da ANOVA e regressão linear simples, foram encontrados dois marcadores (Satt 239 e Satt 384) associados à QTLs que explicavam 19,04% e 7,42% da variação do fenótipo. Empregando-se regressão linear múltipla com o procedimento stepwise, esses mesmos QTLs foram mantidos e explicaram 26,01% da variação fenotípica. Utilizando-se o mapeamento por intervalo simples no GL E, foi estimado o efeito aditivo do QTL (+ 0,54) na expressão do caráter e determinada a posição do marcador em relação ao QTL. Esta marca foi posicionada muito próxima ou coincidente do QTL, o que resulta em uma marca extremamente confiável para futuros trabalhos de seleção assistida.Item Avaliação de resíduos de transgênicos em alimentos no Brasil e desenvolvimento de metodologias de análise(Universidade Federal de Viçosa, 2006-08-07) Marcelino, Francismar Corrêa; Guimarães, Marta Fonseca Martins; http://buscatextual.cnpq.br/buscatextual/visualizacv.do?id=K4790685D6; Otoni, Wagner Campos; http://buscatextual.cnpq.br/buscatextual/visualizacv.do?id=K4786133Y6; Barros, Everaldo Gonçalves de; http://buscatextual.cnpq.br/buscatextual/visualizacv.do?id=K4781285J6; http://buscatextual.cnpq.br/buscatextual/visualizacv.do?id=K4706159Y3; Guimarães, Valéria Monteze; http://buscatextual.cnpq.br/buscatextual/visualizacv.do?id=K4798758T3; Oliveira, Luiz Orlando de; http://buscatextual.cnpq.br/buscatextual/visualizacv.do?id=K4781626T2Desde a liberação da primeira variedade transgênica para consumo humano, o tomate Flavr savr , em 1995, o aumento no plantio e comercialização de organismos geneticamente modificados (OGMs) já aumentou mais de 50 vezes, atingindo em 2005 a cifra de 90 milhões de hectares plantados com algum tipo de OGM em 21 países. Estima-se que em 2006 esta cifra supere 100 milhões de hectares. No Brasil, a liberação do plantio e comércio de OGMs ocorreu apenas em 2003, com a soja Roundup Ready® (RR). O aumento do cultivo e comércio de OGMs é refletido no aumento da presença destes na composição dos alimentos. Neste trabalho é apresentado o panorama nacional da presença de OGMs em diferentes produtos analisados pela Empresa AgroGenética, no período de 2000 a 2005. Foram analisados diferentes tipos de alimentos que apresentam, principalmente, soja e/ou milho em sua composição, bem como grãos e produtos in natura, oriundos de diversas regiões do país. De acordo com os resultados, resíduos de OGMs estão presentes nos alimentos comercializados no país desde o primeiro ano em que estes começaram a ser analisados pela empresa; a cada ano, o número de amostras contendo resíduos transgênicos foi se elevando com relação ao total de amostras analisadas, sendo principalmente detectados em alimentos que apresentam alto conteúdo de soja em sua composição, como amostras de salsichas e empanados. Tal situação tem levado à necessidade do desenvolvimento de metodologias que permitam a detecção, quantificação e identificação destes resíduos. Uma das principais dificuldades da análise de resíduos transgênicos em alimentos é a necessidade de extrair DNA em quantidade e com qualidade satisfatória para a análise. Deste modo, o presente trabalho também apresenta o processo de validação da extração de DNA para a análise da presença e quantificação de resíduos transgênicos em amostras de salsichas, a classe de produto analisada que apresentou o maior número de amostras positivas para a presença de resíduos transgênicos (70,73%). Além da obtenção de DNA de boa qualidade, outra etapa crítica para a quantificação de OGMs, pela técnica de PCR quantitativo é a construção da curva de calibração a ser empregada para a análise. O percentual da presença de OGMs em uma amostra é dada em termos absolutos, de modo que uma curva de calibração deve ser construída com padrões que apresentem percentuais de OGMs cuidadosamente definidos. Os padrões de referência são essencias para a determinação do percentual de OGM presente nas amostras, e são específicos para cada tipo de evento e organismo. Atualmente, não se encontram disponíveis no mercado internacional padrões de referência certificados para todos os eventos e variedades transgênicas, e os únicos padrões comercializados são padrões de calibração que variam apenas de 0,1 a 5% em peso de farinha do grão geneticamente modificado (GM) com relação ao peso de farinha do grão normal da espécie em questão. Na etapa final deste trabalho é descrito o desenvolvimento de padrões de calibração baseados em DNA plasmidial. A curva construída com base em DNA plasmidial permitiu a quantificação precisa do percentual de resíduos transgênicos nas amostras quando comparada com a quantificação utilizando DNA genômico obtido de padrões de referência certificados.Item Caracterização de linhagens recombinantes de Penicillium griseoroseum: análise do cariótipo, da expressão dos genes plg 1 e pgg 2 e da produção de pectina liase e poligalacturonase em resposta ao pH do meio(Universidade Federal de Viçosa, 2011-05-23) Teixeira, Janaina Aparecida; Queiroz, Marisa Vieira de; http://buscatextual.cnpq.br/buscatextual/visualizacv.do?id=K4785812Z5; Passos, Flávia Maria Lopes; http://buscatextual.cnpq.br/buscatextual/visualizacv.do?id=K4781817D3; Araujo, Elza Fernandes de; http://buscatextual.cnpq.br/buscatextual/visualizacv.do?id=K4783675E2; http://lattes.cnpq.br/7776451670494630; Tótola, Marcos Rogério; http://buscatextual.cnpq.br/buscatextual/visualizacv.do?id=K4727020U4; Castro, Ieso de Miranda; http://buscatextual.cnpq.br/buscatextual/visualizacv.do?id=K4787281A9; Silveira, Wendel Batista da; http://lattes.cnpq.br/7361036485940798Os estudos genéticos e fisiológicos realizados com o isolado Penicillium griseoroseum CCT6421 ressaltam as vantagens para a sua aplicação como hospedeiro para produção de proteínas. A obtenção e análise de linhagens recombinantes de P. griseoroseum com alta produção de pectina liase (PL) e poligalacturonase (PG) evidenciaram o eficiente sistema de secreção desse fungo, indicando a possibilidade de utilização deste como plataforma para produção de proteínas de interesse industrial. Entretanto, pouco é conhecido sobre a organização do genoma de P. griseoroseum e das linhagens recombinantes. Neste trabalho foi estimado o tamanho do genoma de P. griseoroseum entre 29,8 e 31,0 Mb, distribuídos em quatro cromossomos. O gene plg1, que codifica PL, está em cópia única no genoma de P. griseoroseum e foi localizado no cromossomo II (9,22 Mb). A linhagem recombinante T105, que possui cópias adicionais do gene plg1 sob controle do promotor de gpd de Aspergillus nidulans, apresentou integrações nos cromossomos II, III e IV. As linhagens recombinantes T146 e T20 possuem, respectivamente, cópias adicionais do gene pgg2 e dos genes pgg2 e plg1, sob o controle do promotor de gpd de A. nidulans. O gene pgg2 codifica PG em P. griseoroseum. A análise da expressão dos genes plg1 e pgg2, nas linhagens recombinantes de P. griseoroseum multi-cópias, mostrou que o aumento do número de cópias dos genes proporciona o aumento da produção enzimática. Uma cópia do gene plg1, sob o controle do promotor constitutivo, proporcionou um aumento de 200 vezes na expressão em relação ao gene endógeno e duas cópias do gene pgg2, também sob o controle do promotor constitutivo, proporcionaram um aumento de 1100 vezes na expressão em relação ao gene endógeno. A produção e secreção de PL e PG pelas linhagens recombinantes T105, T146 e T20 de P. griseoroseum são afetadas pelas condições de cultivo. As linhagens foram cultivadas em meio tamponado MMT (pH 6,8) e em meio não-tamponado MMNT (pH 6,3 3,0), para verificar a expressão dos genes plg1 e pgg2, produção e secreção de PL e PG em diferentes tempos de cultivo. A transcrição dos genes plg1 e pgg2, nas linhagens recombinantes, é constitutiva e não foi detectado variação em ambos os meios. No entanto, a quantidade de proteína total secretada variou em média 7,8 ± 1,1 μg/mL no meio MMT e 3,25 ± 1,50 μg/mL no meio MMNT. A análise por SDS-PAGE das proteínas do sobrenadante da cultura das linhagens possibilitou verificar uma maior quantidade de PL e PG secretada no meio MMT do que no meio MMNT. A secreção de PL e de PG foram afetadas pela variação do pH do meio, apresentando reduções nas atividades de 6,4 e 3,6 vezes, respectivamente, para a atividade detectada em meio MMNT em comparação ao meio MMT. A variação do pH do meio também alterou a morfologia da hifa e do micélio da linhagem recombinante T20, o que pode estar relacionado com a redução da secreção de PL e PG. Os resultados mostram que a maquinaria de transcrição, tradução e secreção de proteínas do fungo P. griseoroseum responde ao aumento do número de cópias de genes no genoma, observando-se as condições de cultivo.Item Caracterização do secretoma de Phakopsora pachyrhizi expresso durante a interação com a soja(Universidade Federal de Viçosa, 2011-07-19) Zaramela, Lívia Soares; Furtado, Gleiber Quintão; http://lattes.cnpq.br/1676492508949464; Queiroz, Marisa Vieira de; http://buscatextual.cnpq.br/buscatextual/visualizacv.do?id=K4785812Z5; Brommonschenkel, Sérgio Hermínio; http://buscatextual.cnpq.br/buscatextual/visualizacv.do?id=K4780948Y4; http://lattes.cnpq.br/0449859389824722; Mizubuti, Eduardo Seiti Gomide; http://buscatextual.cnpq.br/buscatextual/visualizacv.do?id=K4785633J8Durante a interação com o hospedeiro, fungos biotróficos, como as espécies causadoras das ferrugens, secretam um arsenal de proteínas (efetores) envolvidas na supressão da resposta de defesa e manipulação do metabolismo do hospedeiro. Essas proteínas efetoras são direcionadas para o apoplasto ou para o citoplasma das plantas por uma rota ainda desconhecida, onde atuam promovendo a infecção. Algumas dessas proteínas efetoras, denominadas proteínas Avr, são reconhecidas por proteínas codificadas por genes de resistência, o que desencadeia a resposta de hipersensibilidade e fenótipo de resistência. Já foram descritos sete genes R que conferem resistência à ferrugem asiática da soja causada pelo fungo P. pachyrhizi. Todavia, ainda não foram identificadas as proteínas efetoras (Avr) reconhecidas pelas proteínas codificadas pelos genes Rpp, ou efetuada uma análise detalhada dos genes de P. pachyrhizi que codificam proteínas secretadas durante a sua interação com a soja. Desta forma, o objetivo deste trabalho foi identificar genes de P. pachyrhizi que codificam proteínas secretadas utilizando o sistema armadilha de sinal de secreção em leveduras (YST). A partir da triagem da biblioteca YST, foram selecionados 2054 clones positivos. A partir desses clones foram obtidas 1777 sequências da extremidade 5´ com qualidade phred > 20, que foram agrupadas em 95 contíguos e 66 singletos. Análises comparativas com sequências depositadas nos bancos de dados de ESTs de soja e de proteínas não redundantes do Genbank/NCBI resultaram na identificação de 48 contíguos e 16 singletos sem similaridade a sequências de soja (no hit). Estas sequências no hit são potenciais genes de origem fúngica. Para corroborar com esta hipótese, as sequências no hit foram comparadas com o banco de dados do NCBI de sequências genômicas de P. pachyrhizi NCBI, sendo que 20 contíguos e 4 singletos apresentaram similaridade significativa com sequências depositadas neste banco de dados. Quando comparadas com sequências de proteínas do Puccinia Database Protein pelo programa BlastX, 12 ORFs preditas codificam proteínas com similaridade significativa com proteínas de Puccinia. A predição de peptídio sinal através do SignalP foi positiva para 88,9% das ORFs deduzidas. Além disso, 87,7% das ORFs deduzidas também apresentaram predição para secreção pelo programa TargetP, e 92,6% não apresentam predição para domínio transmembrana. Dentre as proteínas codificadas por estes genes, duas apresentaram motivo semelhante ao RxLx-dEER de oomicetos, e uma proteína com motivo semelhante ao Y/F/WxC encontrado em candidatos a efetores de oídios. Foram também identificadas três regiões protéicas conservadas, ainda não relatadas na literatura. A predição para pontes de dissulfeto foi positiva para 14 proteínas deduzidas. A sequência completa foi obtida para 29 genses, que foram selecionados para caracterização funcional, sendo que destes, 12 já haviam sido previamente identificados em estudos anteriores realizados no Laboratório de Genômica. A confirmação da secreção em levedura já foi realizada para nove clones. Ensaios de secreção para os demais genes estão sendo realizados. O monitoramento da expressão dos genes identificados e a sua análise de expressão transiente em genótipo resistentes serão utilizados para determinação a sua função na patogênese.Item Caracterização dos genes que codificam os inibidores de protease Bowman-Birk (BBI) e transformação de nós cotiledonares para o silenciamento gênico de BBI em sementes de soja(Universidade Federal de Viçosa, 2010-09-09) Barros, Beatriz de Almeida; Moreira, Maurílio Alves; http://buscatextual.cnpq.br/buscatextual/visualizacv.do?id=K4796105P2; Otoni, Wagner Campos; http://buscatextual.cnpq.br/buscatextual/visualizacv.do?id=K4786133Y6; Barros, Everaldo Gonçalves de; http://buscatextual.cnpq.br/buscatextual/visualizacv.do?id=K4781285J6; http://lattes.cnpq.br/1158626203494670; Fietto, Luciano Gomes; http://buscatextual.cnpq.br/buscatextual/visualizacv.do?id=K4763824H8; Santos, Marcelo de Oliveira; http://buscatextual.cnpq.br/buscatextual/visualizacv.do?id=K4790685H4; Guimarães, Valéria Monteze; http://buscatextual.cnpq.br/buscatextual/visualizacv.do?id=K4798758T3Além de proteínas de reserva, as sementes de soja (Glycine max L. Merrill) acumulam inibidores de proteases, como os inibidores do tipo Bowman-Birk (BBI), que são considerados antinutricionais. A redução desses inibidores em sementes de soja poderia levar ao aumento da biodisponibilidade dos aminoácidos obtidos a partir de alimentos derivados da soja. Os genes que codificam BBI em soja formam uma família multigênica com, no mínimo, cinco membros: BBI-A, BBI-B, BBI-CII, BBI-DII e BBI-EI. O objetivo deste trabalho foi caracterizar os genes que codificam os inibidores de protease Bowman-Birk (BBI) e transformar nós cotiledonares para o silenciamento gênico de BBI em sementes de soja. Análises computacionais mostraram que o genoma da soja apresenta 11 locos que potencialmente codificam BBI. Destes, seis codificam os inibidores do tipo A, C-II e D-II que são expressos somente em sementes. Os perfis de expressão destes membros durante o desenvolvimento da semente são semelhantes. Transcritos para BBI-DII são os mais abundantes, seguidos por BBI-A e BBI-CII. A expressão do gene BBI-D foi comparada, por meio de RT-PCR quantitativo, com a do gene que codifica a subunidade α da proteína de reserva β-conglicinina (α-βC) durante o desenvolvimento da semente. A expressão de BBI-D foi significativamente maior que a expressão de α-βC, indicando que o promotor de BBI-D é um excelente candidato para dirigir a expressão de transgenes em sementes de soja. Para a redução dos teores de BBI em sementes de soja, nós cotiledonares foram transformados via Agrobacterium tumefaciens (linhagem KYRT1) carregando o vetor pBBIAi. No total, 1800 explantes foram transformados, 16 brotos alongaram e destes, 11 desenvolveram raízes. Sete plântulas foram estabelecidas em casa de vegetação. Pequenas amostras de folhas foram coletadas para a extração de DNA e três das amostras apresentaram resultado positivo para a reação de PCR. A baixa eficiência de transformação (0,16%) e alta frequência de escapes estão de acordo com relatos da literatura. Pode-se concluir que o sistema adotado é adequado mas, em trabalhos futuros, modificações relacionadas principalmente ao sistema de seleção e à regeneração dos brotos transformados devem ser consideradas.Item Caracterização e expressão do gene SERK durante a indução de embriogênese somática em soja(Universidade Federal de Viçosa, 2010-09-20) Pereira, Denise Alvares; Barros, Everaldo Gonçalves de; http://buscatextual.cnpq.br/buscatextual/visualizacv.do?id=K4781285J6; Otoni, Wagner Campos; http://buscatextual.cnpq.br/buscatextual/visualizacv.do?id=K4786133Y6; Moreira, Maurílio Alves; http://buscatextual.cnpq.br/buscatextual/visualizacv.do?id=K4796105P2; http://lattes.cnpq.br/0127862812064009; Fietto, Luciano Gomes; http://buscatextual.cnpq.br/buscatextual/visualizacv.do?id=K4763824H8; Lima, Andréia Barcelos Passos; http://buscatextual.cnpq.br/buscatextual/visualizacv.do?id=K4766019H4; God, Pedro Ivo Vieira Good; http://buscatextual.cnpq.br/buscatextual/visualizacv.do?id=K4769361T9A embriogênese somática é uma ferramenta útil para a propagação de plantas e consiste num sistema modelo adequado para a elucidação de eventos iniciais do desenvolvimento embrionário. Estudos genéticos e moleculares focados no desenvolvimento vegetal têm relatado o envolvimento do gene SERK (Somatic Embryogenesis Receptor Kinase) no processo de aquisição de competência embriogênica. Para que seja possível o aumento da eficiência dos processos de regeneração de plantas, é preciso compreendê-los melhor. Dessa forma, os objetivos do presente trabalho foram determinar se o gene SERK está presente no genoma da soja e analisar a sua expressão durante a indução de embriogênese somática. Genes que codificam três novos membros da superfamília de receptores cinase ricos em leucina (LRR-RLK - Leucine-rich repeat receptor like kinase) foram identificados. Esses genes foram denominados GmSERK1, GmSERK2 e GmSERK3, já que compartilham com outros membros da família SERK uma conservada estrutura íntron/éxon e codificam um peptídeo sinal, um zíper de leucina, cinco repetições de leucina (LRR), um domínio rico em prolina (SPP - serine proline proline), um domínio transmembrana e um domínio cinase com 11 subdomínios, características que distinguem os receptores SERK dos demais membros da superfamília LRR-RLK. Com o objetivo de verificar a posição das proteínas GmSERK dentro da superfamília de LRR-RLKs de plantas, partes conservadas de seus domínios extracelular e intracelular foram comparadas a outras sequências de LRR-RLKs retiradas da literatura. Em relação ao domínio LRR, verificou-se que as proteínas SERK apresentam todos os aminoácidos conservados da sequência consenso das LRR de plantas. Além disso, a conservação dos resíduos de ácido aspártico (D) na posição 1, asparagina (N) na posição 4 e glicina (G) na posição 16 em proteínas da família SERK foi observado, embora não seja consenso entre as LRRs de plantas. Uma árvore filogenética foi construída com base nos domínios cinase e os resultados mostraram que as proteínas SERK formam um ramo distinto dos outros tipos de receptores LRR-RLKs e as GmSERKs agrupam-se melhor com outros membros da família SERK, como as de Medicago truncatula (MtSERK1), Teobroma cacao (TcSERK) e Solanum tuberosum (StSERK1). O tratamento dos explantes com ácido 2,4-diclorofenoxiacético (40 mg/L) mostrou-se eficiente em induzir embriões somáticos a partir da cultivar CAC- 1 e um grande número de embriões globulares pode ser visualizado após 30 dias de cultivo. Entretanto, um grande efeito do genótipo na resposta morfogênica foi observado. Ao contrário de CAC-1, explantes derivados da cultivar CS303 apresentaram uma baixa freqüência de indução e apenas um pequeno número de embriões somáticos foi obtido. As análises de expressão, realizadas por meio da técnica de hibridização in situ, mostraram que um alto nível de transcritos correspondentes ao gene GmSERK1 pôde ser detectado em tecidos embriogênicos de CAC-1 durante a fase de indução de embriogênese somática. Em contraste, cotilédones imaturos da cultivar de soja CS303 apresentaram um baixo acúmulo de transcritos de GmSERK1. Estes resultados sugerem o envolvimento do gene GmSERK1 no processo de embriogênese somática, provavelmente atuando como um importante fator na aquisição de competência embriogênica.Item Caracterização funcional da proteína AtWWP1, componente de uma interconexão de fatores da interação geminivirus-hospedeiro envolvido na formação de corpos subnucleares(Universidade Federal de Viçosa, 2013-03-07) Calil, Iara Pinheiro; Bressan, Gustavo Costa; http://lattes.cnpq.br/1153853218347720; Ramos, Humberto Josué de Oliveira; http://lattes.cnpq.br/4037452920080174; Fontes, Elizabeth Pacheco Batista; http://buscatextual.cnpq.br/buscatextual/visualizacv.do?id=K4781848H2; http://lattes.cnpq.br/9424472381660293; Santos, Anésia Aparecida dos; http://lattes.cnpq.br/8527394593088827Estudos moleculares envolvendo o sistema imune de plantas e a infecção por patógenos revelaram um panomara integrado de interações plantapatógeno em que as interações dos efetores de virulência convergem para subconjuntos de proteínas do hospedeiro altamente interconectadas e designadas hubs. Um hub funcional e bem definido do sistema imune de plantas corresponde a interconexões convergentes para a proteína CNS5A que constitui a subunidade catalítica do complexo COP9 signalosome, um regulador chave de diversos processos celulares básicos. Consistente com a previsão de que efetores de diferentes patógenos devem alvejar similares conexões na rede de interações planta-patógeno, foi demonstrado, independentemente, que a proteína C2 de geminivírus, um vírus de DNA que infecta uma grande variedade de culturas agronômicas, interage com a proteína CNS5A. Além disso, foi também demonstrado que tanto a proteína NIG, quanto o receptor imune NIK, ambos alvos da proteína NSP de geminivírus, também interagem com CNS5A. Baseado nestas informações, prevê-se que a interconexão (hub) representada por CNS5A seja um elemento funcional na interação geminivírus-hospedeiro. Recentemente, foi identificado que, além de interagir com CSN5A, a proteína NIG também interage com uma proteína de função desconhecida codificada pelo locus AT2G41020, em leveduras . Como possível componente da rede de interações geminivírus-hospedeiro que converge em CNS5A, AT2G41020 pode interagir direta ou indiretamente com fatores de virulência em resposta de defesa ou de compatibilidade. Sendo assim, os objetivos principais dessa investigação envolveram caracterização bioquímica da proteína codificada pelo locus AT2G41020 e identificação de possíveis interações com proteínas virais e fatores do hospedeiro. Análise in silico da estrutura predita da proteína codificada pelo lócus At2G41020, designada AtWWP1, revelou a presença de dois domínios WW e um domínio C-terminal altamente conservado entre proteínas homólogas de espécies vegetais e animais. Além disso, foi demonstrado que a proteína AtWWP1 é uma proteína nuclear capaz de formar corpos subnucleares via o domínio C-terminal conservado. Ensaios de coimunoprecipitação e BiFC demonstraram que AtWWP1 interage in vivo com a proteína citoplasmática NIG promovendo o seu redirecionamento para corpos nucleares. Com a finalidade de explorar a atividade formadora de corpos nucleares de AtWWP1, a interação entre AtWWP1 e uma segunda proteína parceira AtMBD2 (proteína contendo um domínio de interação com CG metilado) foi caracterizada in vivo. Tanto a capacidade de formar corpos nucleares quanto a interação com AtMBD2 foram mapeadas em AtWWP1 e ocorrem via seu domíno C-terminal conservado, substanciando o argumento de que esta região de AtWWP1 é responsável pela formação de corpos subnucleares. Ensaios de co-localização demonstraram que os corpos nucleares contidos em AtWWP1 são distintos daqueles formados por proteínas envolvidas em splicing do RNA; porém co-localizam com corpos nucleares contendo CDKC2. Além disso, foi demonstrado que AtWWP1 não liga a RNA, mas exibe uma atividade de ligação ao DNA. Estas características implicam que AtWWP1 deve estar envolvida com funções nucleares básicas. Como componente de um hub funcional na interação geminivírus-hospedeiro, torna-se relevante avaliar se a infecção viral afetaria os corpos nucleares formados por AtWWP1.Item Caracterização molecular de cultivares de soja por meio de um sistema de genotipagem fluorescente utilizando marcadores microssatélites com cauda estendida universal(Universidade Federal de Viçosa, 2011-07-04) Ribeiro, Carlos Alexandre Gomes; God, Pedro Ivo Vieira Good; http://buscatextual.cnpq.br/buscatextual/visualizacv.do?id=K4769361T9; Marcelino, Francismar Corrêa; http://buscatextual.cnpq.br/buscatextual/visualizacv.do?id=K4706159Y3; Barros, Everaldo Gonçalves de; http://buscatextual.cnpq.br/buscatextual/visualizacv.do?id=K4781285J6; http://lattes.cnpq.br/4896054241001552; Piovesan, Newton Deniz; http://buscatextual.cnpq.br/buscatextual/visualizacv.do?id=K4728400U5O desenvolvimento de sistemas de identificação molecular para determinar e rastrear a identidade genética de um cultivar representa um grande desafio ao sistema de proteção utilizado no país, até então fundamentado em descritores fenotípicos. A identificação de cultivares de soja é feita atualmente no Brasil com base em 30 descritores morfológicos. Marcadores moleculares do tipo microssatélite são largamente utilizados para fins de determinação da diversidade genética, paternidade, análises de pureza varietal e mapeamento genético. Algumas variações da técnica de genotipagem convencional por microssatélite vêm sendo desenvolvidas com o objetivo de adequar a velocidade e automatização de técnicas atuais, com qualidade de análise e baixo custo. Dentre elas, destaca-se um sistema multiplex de genotipagem em sequenciador semi-automático de DNA, que utiliza primers com cauda estendida universal (PCEU). O presente trabalho teve como objetivos padronizar um sistema reprodutível de genotipagem molecular semi-automatizado baseado na metodologia PCEU para a cultura da soja, avaliar diferenças em relação ao sistema de genotipagem convencional, em gel de poliacrilamida e caracterizar com o conjunto de marcadores selecionados, 30 cultivares de soja estimando suas frequências alélicas. Estes descritores genotípicos poderão ser utilizados como ferramenta para a identificação de cultivares e fornecer subsídios para a proteção da propriedade intelectual, determinação e comprovação de pureza varietal. Foram utilizados 30 cultivares comerciais de soja avaliados com um grupo de 22 marcadores microssatélites já descritos na literatura. A genotipagem foi realizada em sequenciador semi- automático (PCEU) e em gel de poliacrilamida (convencional). Dentre os locos analisados, 13 foram selecionados por apresentarem melhor perfil de amplificação, menos produtos stutter, e maior número de alelos. O perfil alélico de cada cultivar foi definido primeiramente em sistema tradicional de genotipagem por eletroforese em gel de poliacrilamida, e depois no sequenciador semi-automatizado. Para a metodologia de genotipagem PCEU, o número total de alelos encontrados foi de 50, variando de 2 (Satt045) a 7 (Satt005). O conteúdo de informação polimórfica (PIC) variou de 0,40 (Satt045) a 0,74 (Satt005) com média de 0,62. Para a metodologia convencional o número de alelos encontrados foi de 38 com uma variação de 2 (Satt045, Satt070 e AF162283) a 5 (Satt005) alelos. O PIC apresentou uma faixa 0,39 (Satt045) a 0,67 (Satt079), com média de 0,56. Os valores de probabilidade de identidade ao acaso diferiram entre os métodos, sendo <10-5 (PCEU) e <10-4 (Convencional). Apesar de diferenças pontuais, observou-se alta correlação entre as matrizes de dissimilaridade genética entre os métodos (0,8026), e os grupos formados apresentaram também alta similaridade e foram concordantes com dados fenotípicos de registro varietal e de genealogia. Além da alta sensibilidade na detecção de alelos de tamanhos muito próximos, o método PCEU permitiu uma identificação mais criteriosa dos artefatos de amplificação. Os grupos de marcadores selecionados em ambas as metodologias permitiram distinguir todas as cultivares analisadas. O método PCEU possui baixo custo quando comparado a técnicas comuns de marcação por fluorescência, além disso, sua alta precisão faz deste um método vantajoso para a caracterização de cultivares e determinação da pureza genética. O grupo de marcadores analisados pode ser usado como um conjunto de descritores genotípicos complementar aos descritores fenotípicos obrigatórios utilizados para fim de proteção de cultivares em testes de distinguibilidade.Item Caracterização molecular e análise da variabilidade genética do Papaya lethal yellowing virus (PLYV), e triagem de fontes de resistência ao vírus em germoplasma de Carica papaya L.(Universidade Federal de Viçosa, 2011-07-28) Pereira, álvaro Julio; Carvalho, Claudine Márcia; http://buscatextual.cnpq.br/buscatextual/visualizacv.do?id=K4794965T6; Alfenas, Acelino Couto; http://lattes.cnpq.br/2514320654462590; Zerbini Júnior, Francisco Murilo; http://buscatextual.cnpq.br/buscatextual/visualizacv.do?id=K4783743U5; http://lattes.cnpq.br/9277969398728565; Andrade, Eduardo Chumbinho de; http://buscatextual.cnpq.br/buscatextual/visualizacv.do?id=K4767872E8; Barros, Danielle Ribeiro de; http://buscatextual.cnpq.br/buscatextual/visualizacv.do?id=K4776125E2; Zerbini, Poliane Alfenas; http://lattes.cnpq.br/8632328159533071O mamão (Carica papaya L.) é uma fruta de grande importância econômica em todo o nordeste brasileiro, região responsável por 60% da produção nacional. Mamoeiros nos estados do Ceará e Rio Grande do Norte são afetados pelo amarelo letal, causado pelo Papaya lethal yellowing virus (PLYV). A fim de estimar a variabilidade genética de isolados de PLYV, amostras foliares de mamoeiro foram coletadas em regiões produtoras dos estados do Ceará e Rio Grande do Norte. Fragmentos de 16 isolados virais com aproximadamente 900 pb, correspondente à região central do genoma viral, foram amplificados via RT-PCR, clonados e sequenciados. A análises das sequências indicou >97% de identidade entre os isolados, entre 94-100% com o isolado de PLYV previamente sequenciado, e uma identidade menor, mas significativa, com vírus pertencentes ao gênero Sobemovirus. Estes resultados indicam um baixo grau de variabilidade genética entre isolados de PLYV. O genoma viral foi sequenciado em sua totalidade utilizando a plataforma Roche 454 GS-FLX Titanium. A análise da sequência indica a presença de uma primeira ORF com o potencial de codificar uma proteína sem identidade significativa com nenhuma outra proteína, duas ORFs parcialmente sobrepostas com o potencial de codificar uma RNA-dependente RNA polimerase e uma quarta ORF com o potencial de codificar a proteína capsidial. A RdRp e a CP apresentam identidade de sequência significativa com as proteínas correspondentes de outros sobemovírus. Apesar da ausência de identidade da ORF1, a organização do genoma praticamente idêntica à dos sobemovírus, inclusive com uma possível mudança de fase entre as duas ORFs que codificam a RdRp, e a identidade das demais ORFs confirmam a classificação do PLYV como uma espécie do gênero Sobemovirus. Com o objetivo de avaliar a possível existência de genótipos de mamoeiro com resistência/tolerância ao PLYV, foi realizado um estudo utilizando-se 60 acessos provenientes do Banco Ativo de Germoplasma da Embrapa Mandioca e Fruticultura. As plantas foram inoculadas via extrato vegetal tamponado em um delineamento inteiramente casualizado. As avaliações foram realizadas 90 dias após a inoculação por meio de ELISA indireto, empregando-se um anti-soro policlonal. Os resultados indicaram que os acessos CMF11, 15, 20, 21, 22, 26, 30, 33, 36, 38, 44, 47, 52, 54, 60, 72, 76, 82, 88, 92, 94, 102, 108, 114, 116, 120, 121, 123, 129, 130, 132, 150, 155, 166, 172, 175, 176, 183,186, 200, 204, 206, 220, 223, 230, 233, 234 e 235 são prováveis fontes de resistência ao vírus. Caso esses resultados sejam confirmados, estes acessos poderão ser utilizados em programas de melhoramento genético visando a incorporação de resistência ao amarelo letal em cultivares comerciais de mamoeiro.Item Construção de cassetes de expressão para silenciamento gênico de fatores antinutricionais da soja, via interferência por RNA(Universidade Federal de Viçosa, 2006-09-29) Barros, Beatriz de Almeida; Barros, Everaldo Gonçalves de; http://buscatextual.cnpq.br/buscatextual/visualizacv.do?id=K4781285J6; http://lattes.cnpq.br/1158626203494670; Oliveira, Luiz Orlando de; http://buscatextual.cnpq.br/buscatextual/visualizacv.do?id=K4781626T2; Otoni, Wagner Campos; http://buscatextual.cnpq.br/buscatextual/visualizacv.do?id=K4786133Y6; Ribon, Andréa de Oliveira Barros; http://buscatextual.cnpq.br/buscatextual/visualizacv.do?id=K4727026E6; Lima, Andréia Barcelos Passos; http://buscatextual.cnpq.br/buscatextual/visualizacv.do?id=K4766019H4A soja é uma das mais importantes culturas do mundo e como apresenta um alto teor protéico, ela tem sido muito utilizada na alimentação animal e humana. Apesar disso, as proteínas encontradas na semente desta leguminosa não são consideradas ideais por apresentarem baixo teor de metionina e lisina, além de fatores alergênicos e de inibidores de proteases. Dentre estes fatores antinutricionais estão a proteína P34 e os inibidores de protease do tipo Bowman-Birk. A ausência destes fatores aumentaria a qualidade da semente de soja, bem como a tornaria disponível para uma faixa mais ampla de consumidores. Recentes avanços na biotecnologia vegetal têm possibilitado o silenciamento completo ou em altos níveis de genes específicos. Uma destas técnicas é conhecida como interferência por RNA ou RNA interference. Este método é altamente eficiente e a clivagem do mRNA alvo é induzida pela presença de pequenos RNAs dupla fita na célula. O objetivo deste trabalho foi a construção de cassetes de expressão para silenciamento gênico, via interferência por RNA, dos inibidores de protease do tipo Bowman-Birk e da proteína P34 em sementes de soja. Para a expressão semente-específica dos transgenes, primers específicos foram desenhados para a amplificação da região promotora do gene da subunidade [alfa] da [beta]-conglicinina. A estes oligonucleotídeos foram adicionados sítios de restrição Sac I e Xho I - adequados para sua clonagem em vetores de expressão em plantas. Foram clonados 634 pb no vetor pGEM-TEasy. A clonagem foi confirmada por PCR, clivagem enzimática e sequenciamento do clone isolado. A seqüência clonada foi analisada in silico para a identificação de cis-elementos relacionados à expressão semente específica de genes colocados sob controle deste promotor. Os elementos TATA box, CAAT box, RY LEG box e RY FLEB box encontrados. O fragmento de interesse foi, então, isolado do vetor pGEM-TEasy por clivagem com as enzimas Sac I e Xho I e inseridos em vetores de expressão em plantas (pKANNIBAL) originando o vetor pBKN. Para a construção dos cassetes de expressão, a escolha da região do cDNA de cada gene de interesse a ser amplificada foi determinada com o auxílio do programa BLOCK-iTTM RNAi Designer (INVITROGEN), e os primers específicos foram desenhados de acordo seqüências depositadas no banco de dados público GenBank. Inicialmente foi feita, por meio de RTPCR, uma análise da expressão dos genes de interesse durante o desenvolvimento da semente e em demais órgãos da planta (raiz, caule e folha). Essa análise evidenciou expressão contínua e abundante desses genes durante todo o desenvolvimento da semente bem como a presença de transcritos correspondentes em todos os órgãos vegetais analisados. Após sua amplificação, todos os fragmentos obtidos a partir de cDNA de semente foram sequenciados e sua identificação foi confirmada por meio de alinhamento utilizando o programa BLAST. Para a clonagem da seqüência sense, os vetores pKANNIBAL e pBKN, além dos fragmentos amplificados referentes aos genes de interesse, foram clivados com as enzimas Xho I e Kpn I. A reação de ligação foi realizada utilizando T4 DNA ligase e células de Escherichia coli ultracompetentes foram transformadas por meio de choque térmico. Os transformantes foram analisados por PCR e reação de clivagem enzimática. A clonagem do fragmento antisense foi realizada da mesma forma, utilizando as enzimas Xba I e Cla I e os clones contendo o fragmento sense como vetores. Em seguida, as construções foram transferidas para o vetor binário pCAMBIA 3301 e confirmadas por PCR.Item Diversidade genética de Zabrotes subfasciatus Boheman (Coleoptera: Bruchidae) avaliada com marcadores ISSR(Universidade Federal de Viçosa, 2007-02-28) Souza, Giselle Anselmo de; Martins, Ernane Ronie; http://buscatextual.cnpq.br/buscatextual/visualizacv.do?id=K4723823P8; Oliveira, Luiz Orlando de; http://buscatextual.cnpq.br/buscatextual/visualizacv.do?id=K4781626T2; http://buscatextual.cnpq.br/buscatextual/visualizacv.do?id=K4775161Y2; Santos, Jorge Abdala Dergam dos; http://buscatextual.cnpq.br/buscatextual/visualizacv.do?id=K4780131D9; Salomão, Tânia Maria Fernandes; http://buscatextual.cnpq.br/buscatextual/visualizacv.do?id=K4787017A5; Vieira, Rogério Faria; http://buscatextual.cnpq.br/buscatextual/visualizacv.do?id=K4780045J0Zabrotes subfasciatus Boheman (Coleoptera: Bruchidae), espécie originária provavelmente na América Central, se tornou uma praga agrícola quando se estabeleceu e passou a se reproduzir continuamente em sementes armazenadas, difundindo-se posteriormente pelas regiões tropicais e subtropicais. Em armazéns, esses insetos causam danos aos grãos, perfurando-os e conferindo-lhes sabor desagradável, depreciando o seu valor comercial. Nas sementes, a praga consome as reservas dos cotilédones, comprometendo a germinação. O objetivo deste trabalho foi estimar a diversidade genética de populações de Z. subfasciatus por meio de marcadores moleculares ISSR (Inter Simple Sequence Repeat). Foram avaliadas 12 populações de Z. subfasciatus, amostradas em oito estados brasileiros, totalizando 269 indivíduos. Cinco primers ISSR foram utilizados (UBC 807, UBC 808, UBC 809, UBC 811, UBC 891), sendo amplificadas um total de 51 bandas polimórficas com média de 10 bandas por primer. A porcentagem de polimorfismo dentro de cada população variou de 74,51 a 92,16, com porcentagem média de 83,82. A heterozigosidade esperada corrigida de Nei (HE), variou de 0,2253 a 0,3281, com média de 0,2885 e o índice de diversidade genética de de Shannon e Weaver (I) variou de 0,2908 a 0,4805, com média de 0,4167. Em nível de espécie, estes dois índices apresentaram valores de 0,3636 e 0,5393 respectivamente. Os valores de FST entre pares de populações obtidos pela análise de variância molecular (AMOVA) variaram de 0,06804 a 0,6165. A distância genética de Nei (1978), usada para estimar a divergência genética entre populações, variou de 0,0563 a 0,3250. A AMOVA permitiu uma partição da variação genética em dois níveis: dentro de populações e entre populações. Foi observada maior variação genética dentro da população, com 66% da variação total. Apenas 34% da variação genética foi observada entre populações. O teste de Mantel revelou baixa correlação entre distância geográfica e FST, identidade genética e FST e entre distância genética de Nei e FST. Pode-se concluir que a variabilidade genética da espécie ainda é considerada baixa no Brasil, provavelmente devido à introdução recente da praga. As populações de Zabrotes subfasciatus avaliadas não se apresentam geograficamente estruturadas no Brasil.Item Diversidade molecular de Phakopsora pachyrhizi em genótipos de soja com diferentes genes de resistência a ferrugem(Universidade Federal de Viçosa, 2013-03-06) Jorge, Vanderson Ricardo; Soares, Ana Paula Gomes; http://lattes.cnpq.br/3631825469916595; Rossi, Ana Aparecida Bandini; http://buscatextual.cnpq.br/buscatextual/visualizacv.do?id=K4778127Z7; Oliveira, Luiz Orlando de; http://buscatextual.cnpq.br/buscatextual/visualizacv.do?id=K4781626T2; http://lattes.cnpq.br/8569549818120493; Pereira, Olinto Liparini; http://buscatextual.cnpq.br/buscatextual/visualizacv.do?id=K4767879D4A Ferrugem Asiática da Soja é uma das principais doenças da cultura da soja causando grandes danos econômicos para o agronegócio. Genes para resistência à ferrugem tem sido relatados, porém a resistência conferida aos cultivares ainda é parcial. O objetivo da pesquisa foi avaliar a diversidade do fungo P. pacyrhizi a partir de amostras ambientais originadas de experimentos cultivados com genótipos suscetíveis e genótipos com gene para resistência à ferrugem. As regiões gênicas do espaçador transcrito interno (ITS) e o gene para o Fator de ribosilação do ADP foram amplificadas, clonadas e sequenciadas. As sequências obtidas foram reunidas em bancos de dados para ambas as regiões em estudo. Os resultados das análises evidenciaram a presença de 6 haplótipos para a região de ADP e 14 ribótipos para a região de ITS, estando distribuídos de modo semelhante entre os genótipos de soja com diferentes níveis de resistência. Análises de estrutura de populações demonstram que a variabilidade genética para P. pachyrhizi concentra-se nas populações dentro de uma mesma localidade, não havendo diferenças significantes entre localidades avaliadas. A presença de genes que conferem resistência à alguns genótipos não influenciou na distribuição de ribótipos para os locais em estudo. A similaridade entre diferentes localidades amostradas, e diferente genótipos indicam um intenso fluxo gênico que pode ser resultado da dispersão de esporos a longa distância pelo vento.Item Estrutura genética da população de Sclerotinia sclerotiorum em feijoais de Minas Gerais(Universidade Federal de Viçosa, 2011-07-25) Lehner, Miller da Silva; Mizubuti, Eduardo Seiti Gomide; http://buscatextual.cnpq.br/buscatextual/visualizacv.do?id=K4785633J8; Paula Júnior, Trazilbo José de; http://lattes.cnpq.br/7899276097018876; Carneiro, José Eustáquio de Souza; http://buscatextual.cnpq.br/buscatextual/visualizacv.do?id=K4783648T9; http://lattes.cnpq.br/0340004944894539; Vieira, Rogério Faria; http://buscatextual.cnpq.br/buscatextual/visualizacv.do?id=K4780045J0O conhecimento sobre a estrutura genética da população de Sclerotinia sclerotiorum é importante para direcionar as estratégias de controle do mofo-branco do feijoeiro, principalmente o desenvolvimento e uso de cultivares resistentes ao patógeno. Objetivou-se estudar a estrutura genética das populações de S. sclerotiorum em lavouras de feijão em Minas Gerais. Analisaram-se 127 isolados provenientes de quatro regiões produtoras de feijão (subpopulações) em Minas Gerais quanto ao polimorfismo identificado por oito marcadores microssatélites. Houve alta diversidade genética, com maior parte da variação decorrente de diferenças entre indivíduos dentro das subpopulações. Identificaram-se 65 haplótipos, sendo 49 representados por um único isolado e 59 alelos. Não houve evidência de acasalamento aleatório nas subpopulações. Maior fração clonal foi registrada na subpopulação da Zona da Mata. A população está moderadamente estruturada. Contudo, não houve diferenciação genética entre as subpopulações do Noroeste, Zona da Mata e Triângulo Mineiro. Houve diferença da subpopulação Sul em relação às demais. Pela análise de agrupamento detectou-se a existência de seis grupos, com a presença de imigrantes entre eles. A maioria dos isolados da subpopulação Sul constituiu um único grupo. Nos outros grupos houve mistura de indivíduos das diferentes subpopulações. A alta variabilidade genética observada nas populações de S. sclerotiorum, implica em maiores cuidados na seleção de materiais resistentes ao mofo branco. O processo de seleção deve ser realizado em diferentes regiões de Minas Gerais a fim de minimizar os riscos de suplantação de resistência.Item Estudo do envolvimento das proteínas Sl-Gal83 e TCTP na infecção de hospedeiros suscetíveis pelo potyvírus Pepper yellow mosaic virus (PepYMV)(Universidade Federal de Viçosa, 2011-02-28) Cascardo, Renan de Souza; Zerbini, Poliane Alfenas; http://lattes.cnpq.br/8632328159533071; Carvalho, Claudine Márcia; http://buscatextual.cnpq.br/buscatextual/visualizacv.do?id=K4794965T6; Zerbini Júnior, Francisco Murilo; http://buscatextual.cnpq.br/buscatextual/visualizacv.do?id=K4783743U5; http://lattes.cnpq.br/7577204500987847; Queiroz, Marisa Vieira de; http://buscatextual.cnpq.br/buscatextual/visualizacv.do?id=K4785812Z5O genoma da maioria dos vírus que infectam plantas codifica apenas 4-10 proteínas, que são necessárias para completar o ciclo de infecção, incluindo as etapas de replicação do genoma viral, movimento célula-a-célula e movimento sistêmico. Para uma infecção bem sucedida, as proteínas virais devem interagir com fatores do hospedeiro, modulando processos metabólicos e coordenando uma rede complexa de interações bioquímicas e moleculares a favor do patógeno. Uma biblioteca subtrativa foi construída a partir de plantas de tomateiro suscetíveis infectadas pelo potyvírus Pepper yellow mosaic virus (PepYMV). Foram identificados vários genes potencialmente envolvidos nas etapas iniciais do processo de infecção viral. Dentre os genes identificados encontram-se os genes que codificam as proteínas Translationally controlled tumor protein (TCTP) e o homólogo de tomate de Saccharomyces cerevisae Gal83 (Sl-Gal83), uma proteína do complexo Sucrose non-fermenting-1 (SNF1). TCTP é uma proteína altamente conservada em eucariotos, e está envolvida em vários processos celulares básicos, como crescimento celular, progressão do ciclo celular, morte celular programada e proteção contra diversos tipos de estresses. SNF1 desempenha um papel importante na ativação da transcrição e expressão de genes envolvidos na resposta celular aos diferentes tipos de estresses, tais como limitação de nutrientes, salinidade elevada, choque térmico e infecção viral. O objetivo deste trabalho foi estudar o papel das proteínas TCTP e Sl-Gal83 durante o processo de infecção pelo PepYMV em hospedeiros suscetíveis. Plantas transgênicas de tomate cv. Moneymaker silenciadas para estes genes foram produzidas e inoculadas mecanicamente com o PepYMV. O estabelecimento da infecção viral foi avaliado por ELISA e qRT-PCR. Plantas não-transformadas foram infectadas, enquanto as plantas silenciadas permaneceram assintomáticas. Nas plantas silenciadas o ELISA apresentou resultado negativo e a carga viral foi reduzida. A localização subcelular de TCTP em plantas sadias e infectadas pelo PepYMV foi analisada por microscopia confocal utilizando-se uma fusão YFP-TCTP. Em plantas sadias a localização subcelular de TCTP é citoplasmática, conforme descrito para outros organismos. Quarenta e oito horas após a infecção pelo PepYMV, TCTP foi redirecionada para o núcleo. Para determinar qual é a proteína viral que direciona a relocalização de TCTP para o núcleo, cada uma das proteínas virais (P1, HC-Pro, P3, PIPO, P3N-PIPO, CI, 6K2, NIa, NIb e CP) foi coinfiltrada individualmente com pYFP-TCTP. Os resultados mostraram que TCTP acumula predominantemente no núcleo quando co-infiltrada com CI e NIa, e está igualmente distribuída no núcleo e citoplasma, quando co-infiltrada com P1, PIPO, P3NPIPO, 6K2 e NIb. Em plantas co-infiltradas com HC-Pro, P3 e CP, TCTP permaneceu no citoplasma. Para identificar possíveis proteínas virais e/ou do hospedeiro que interagem com TCTP foi realizado um ensaio de purificação por afinidade em tandem. A análise por SDS-PAGE de extratos protéicos de plantas expressando nTAPi-TCTP mostrou duas bandas entre 40 e 50 kDa presentes no extrato purificado. Os fragmentos foram analisados por espectrometria de massa, porém não foi possível identificar as proteínas. Provavelmente o limitante para uma detecção mais eficiente foi a baixa concentração de proteínas eluídas. Com isso, torna-se necessário a otimização do protocolo de extração/eluição para a obtenção de uma maior concentração de proteínas complexadas com nTAPi-TCTP. Em conjunto, os resultados obtidos neste trabalho sugerem que tanto TCTP quanto Sl-Gal83 possuem papéis fundamentais na interação PepYMV-tomate, sendo necessárias para o estabelecimento de uma infecção sistêmica. Estudos adicionais devem ser realizados para melhor compreensão da natureza e dos mecanismos das interações entre TCTP, Sl-Gal83 e o PepYMV.Item Filogeografia molecular de Phakopsora pachyrhizi com base em dados de sequenciamento de regiões gênicas do DNA nuclear(Universidade Federal de Viçosa, 2011-07-27) Freire, Maíra Cristina Menezes; Moreira, Maurílio Alves; http://buscatextual.cnpq.br/buscatextual/visualizacv.do?id=K4796105P2; Mizubuti, Eduardo Seiti Gomide; http://buscatextual.cnpq.br/buscatextual/visualizacv.do?id=K4785633J8; Oliveira, Luiz Orlando de; http://buscatextual.cnpq.br/buscatextual/visualizacv.do?id=K4781626T2; http://lattes.cnpq.br/3082926024236186; Santos, Jorge Abdala Dergam dos; http://buscatextual.cnpq.br/buscatextual/visualizacv.do?id=K4780131D9; Guimarães, Valéria Monteze; http://buscatextual.cnpq.br/buscatextual/visualizacv.do?id=K4798758T3; Zambolim, Eunize Maciel; http://buscatextual.cnpq.br/buscatextual/visualizacv.do?id=K4783380J6; Paula Júnior, Trazilbo José de; http://lattes.cnpq.br/7899276097018876A ferrugem asiática da soja, causada por Phakopsora pachyrhizi, é uma importante doença em todas as áreas produtoras de soja, incluindo os dois países maiores produtores, Brasil e Estados Unidos. Genes de resistência (Rpp) à P. pachyrhizi vêm sendo constantemente pesquisados na soja e em espécies relacionadas, sendo que alguns deles já foram identificados. No entanto, devido à plasticidade genética de P. pachyrhizi, esses genes de resistência são rapidamente suplantados. Com o intuito de avaliar o nível de variabilidade genética de P. pachyrhizi nas principais áreas produtoras de soja no mundo e entender como essa variabilidade é distribuída foi feita uma amostragem de P. pachyrhizi em diferentes países e continentes. A maior parte da amostragem foi feita no Brasil e nos Estados Unidos. A variabilidade genética foi estimada a partir de dados moleculares. Três regiões gênicas nucleares (fator de ribosilação do ADP, histona H4 e ITS) foram amplificadas, clonadas e sequenciadas de amostras de P. pachyrhizi dos diferentes locais. Um banco de dados foi criado com todas as sequências para cada região gênica. As sequências foram comparadas, e os polimorfismos identificados permitiram a diferenciação dos clones. Entre as regiões nucleares, o ITS (espaçador transcrito interno) é a principal marca utilizada para estudos de diversidade genética de fungos, tendo como base o sequenciamento do DNA. As estruturas secundárias formadas pelas regiões de ITS1 e ITS2 de P. pachyrhizi foram utilizadas para: examinar o padrão de polimorfismos de ITS; identificar características estruturais das regiões ITS; investigar a presença de pseudogenes ou artefatos de PCR e avaliar a utilidade do ITS em estudos de diversidade genética de P. pachyrhizi. Os resultados obtidos revelaram que as análises das estruturas secundárias permitiram avaliar a confiabilidade das mutações no ITS de P. pachyrhizi, possibilitando a utilização dessa região para estudos de diversidade genética. O sequenciamento das três regiões gênicas permitiu a diferenciação dos clones em haplótipos. Uma rede foi estimada para cada um dos bancos de dados para entender a relação genealógica entre os haplótipos. Os haplótipos foram plotados em mapas, nos respectivos locais de amostragem, para uma melhor compreensão da distribuição da variabilidade genética de P. pachyrhizi. Foram ainda estimados os índices de diversidade e de fluxo gênico para avaliar a estrutura genética de populações de P. pachyrhizi. Os resultados revelaram que P. pachyrhizi apresenta uma alta variabilidade genética e que grande parte dessa variabilidade está concentrada dentro das populações. Tais características podem ser explicadas pela alta taxa de mutação do fungo e pela alta capacidade de dispersão dos uredósporos, fazendo com que populações de diferentes países e continentes compartilhem os mesmos haplótipos. A comparação da variabilidade genética de P. pachyrhizi entre dois anos agrícolas brasileiros revelaram que o vazio sanitário não foi eficiente no estrangulamento genético de populações desse fungo. Ainda, a identificação dos mesmos haplótipos identificados na soja e no feijão kudzu, revela a relevância desse hospedeiro alternativo nos períodos de ausência de soja no campo. A distribuição geográfica dos haplótipos e as análises de fluxo gênico permitiram inferir as possíveis rotas de dispersão e colonização de P. pachyrhizi. Populações de P. pachyrhizi identificadas no Brasil apresentaram forte relação genealógica com as populações africanas, fortalecendo a hipótese desse continente como fonte de origem das populações brasileiras. Os Estados Unidos apresentaram populações de P. pachyrhizi distantemente relacionadas às identificadas nos outros países, dificultando a inferência do local de sua origem.Item Filogeografia, diferenciação geográfica e caracterização citogenética de populações naturais de Psychotria ipecacuanha das florestas Atlântica e Amazônica(Universidade Federal de Viçosa, 2007-03-01) Rossi, Ana Aparecida Bandini; Carvalho, Carlos Roberto de; http://buscatextual.cnpq.br/buscatextual/visualizacv.do?id=K4780878T0; Santos, Jorge Abdala Dergam dos; http://buscatextual.cnpq.br/buscatextual/visualizacv.do?id=K4780131D9; Oliveira, Luiz Orlando de; http://buscatextual.cnpq.br/buscatextual/visualizacv.do?id=K4781626T2; http://buscatextual.cnpq.br/buscatextual/visualizacv.do?id=K4778127Z7; Caixeta, Eveline Teixeira; http://buscatextual.cnpq.br/buscatextual/visualizacv.do?id=K4728636Z7; Viccini, Lyderson Facio; http://buscatextual.cnpq.br/buscatextual/visualizacv.do?id=K4784356J2Poaia (Psychotria ipecacuanha) é um pequeno arbusto perene que cresce abundantemente em áreas úmidas e sombrias das florestas tropicais do Brasil. A espécie foi utilizada pelos nativos brasileiros que ensinaram as propriedades medicinais aos colonizadores europeus. As raízes de poaia alcançaram utilidades mundiais como expectorante, amebicida, e agente vomitivo, devido à presença de alcalóides isoquinolinicos farmacológicamente ativos. Porém, a intensa coleta de plantas nativas e à negligência de replantio após a coleta das raízes conduziu a um severo declínio de suas pulações nativas. Populações remanescentes ocorrem naturalmente em três regiões extremamente discreta das florestas tropicais: 1) a América central e partes adjacentes da América do Sul; 2) parte do sudoeste da Amazona brasileira; e 3) Floresta Tropical Atlântica ao longo da costa brasileira. Os estudos realizados na presente investigação utilizaram técnicas combinadas que incluiu filogeografia molecular basead em cpDNA, estrutura de população via ISSR, e citogenética para caracterizar populações naturais de poaia das florestas Atlântica e Amazônica do Brasil. As análises permitiram elaborar e avaliar hipóteses dos fatores históricos e ecológicos que moldaram a atual distribuição das populações existentes e adicionar informações para a compreensão da história evolutiva desta importante espécie medicinal. As análises de clado aninhado e análises de ISSR revelaram diferenças notáveis entre as florestas. Diversidade de haplótipo de cpDNA foi maior na Floresta Atlântica, que abrigou 11 dos 12 haplótipos encontrados. Um único haplótipo foi encontrado na Floresta Amazônica. Nenhum dos haplótipos foi compartilhado pelas florestas, o que indica a presença de monofilia recíproca. As análises de clado aninhado indicaram a fragmentação alopátrica como sendo a principal força que moldou as diferenças entre florestas. Quando comparada a Floresta Amazônica, a Floresta Atlântica exibiu altos níveis de diversidade genética como demonstrado pelos maiores valores de HE, HB e I, tanto como uma média das populações como de grupo, como revelado pelas análises de ISSR. AMOVA revelou que a maioria da diversidade genética foi particionada entre tipos de floresta. Fluxo gênico entre florestas é na atualidade insignificante. As análises de citometria de fluxo evidenciaram dois grupos com quantidade de DNA distinta (2C = 1.24 pg e 2C = 2.05 pg). Poaia demonstrou um cariótipo consistindo de 11 pares de cromossomo (2n = 22), dos quais 4 são metacêntricos e 7 são submetacêntricos. As análises de citogenética revelaram que as populações naturais podem estar experienciando poliploidização e sugerem que esta espécie seja tetraplóide. Em geral, as análises indicaram um evento de colonização recente como origem das populações da Floresta Amazônica e uma origem antiga para as populações da Floresta Atlântica. A Floresta Atlântica foi considerada como um centro de diversidade para poaia. Implicações para conservação são discutidas.Item História evolutiva de Phakopsora pachyrhizi no Brasil com base em seqüências de nucleotídeos da região espaçadora interna do DNA ribossomal nuclear(Universidade Federal de Viçosa, 2007-03-02) Freire, Maíra Cristina Menezes; Silva, Marcelo Barreto da; http://buscatextual.cnpq.br/buscatextual/visualizacv.do?id=K4723065P9; Moreira, Maurílio Alves; http://buscatextual.cnpq.br/buscatextual/visualizacv.do?id=K4796105P2; Oliveira, Luiz Orlando de; http://buscatextual.cnpq.br/buscatextual/visualizacv.do?id=K4781626T2; http://lattes.cnpq.br/3082926024236186; Barros, Everaldo Gonçalves de; http://buscatextual.cnpq.br/buscatextual/visualizacv.do?id=K4781285J6; Cruz, Cosme Damião; http://buscatextual.cnpq.br/buscatextual/visualizacv.do?id=K4788274A6; Zambolim, Eunize Maciel; http://buscatextual.cnpq.br/buscatextual/visualizacv.do?id=K4783380J6A soja é atacada por muitos patógenos, porém dentre todas as doenças a ferrugem asiática causada pelo fungo Phakopsora pachyrhizi tem sido considerada como uma das mais importantes. Os sintomas são caracterizados por minúsculos pontos mais escuros do que o tecido sadio, onde se observa uma protuberância, essa se abre em minúsculo poro, expelindo daí, os uredósporo. Plantas severamente infectadas apresentam desfolha precoce, comprometendo a formação e o enchimento de vagens e o peso final dos grãos. O método mais eficiente de controle é o emprego de variedades resistente, entretanto, a grande variabilidade patogênica tem dificultado a pesquisa de tais variedades resistentes. Esse estudo teve como objetivo investigar a distribuição espacial e temporal da atual diversidade genética de Phakopsora pachyrhizi, e inferir sobre as relações evolutivas entre os isolados de origem brasileira e de origem africana e asiática. Uredósporos foram coletados de 20 localidades brasileiras e de localidades na África do Sul. O DNA genômico foi extraído e amplificado por meio de PCR utilizando-se iniciadores específicos para a região de ITS do genoma nuclear de Phakopsora pachyrhizi. As regiões ITS1 e ITS2 foram clonadas e sequenciadas de forma independente. Foram sequenciados quatro clones de cada região ITS por amostra, com o objetivo de verificar se haveria variabilidade do patógeno dentro de uma mesma localidade. As sequências foram alinhadas e comparadas entre si e com sequências de isolados de Phakopsora pachyrhizi de diferentes países obtidas no GenBank. A seguir, o programa TCS foi utilizado para obter redes de haplótipos, uma para as sequências de ITS1, e outra para a região de ITS2. O programa ARLEQUIN foi utilizado para conduzir a análise de variância molecular, calculando a diversidade entre e dentro das localidades amostradas, como também para calcular a diversidade gênica e a diversidade nucleotídica. A rede, com base em sequências provenientes de ITS1, foi capaz de distinguir 21 haplótipos entre as 96 sequências, enquanto que a rede baseada em ITS2 distinguiu 17 haplótipos entre as 86 sequências, indicando que embora P. pachyrhizi tenha sido recentemente introduzida no Brasil, os isolados brasileiros apresentam uma grande variabilidade genética. Essa rede também mostrou que haplótipos amplamente distribuídos no Brasil também foram encontrados na África e Ásia, indicando uma relação de ancestralidade. Pela comparação das sequências, foi observada a presença de cerca de três haplótipos para cada localidade, indicando uma alta diversidade genética dentro da localidade, sendo esse indício comprovado pela análise de variância molecular. Os resultados dão suporte à hipótese de que, a origem desse fungo no Brasil tenha sido por meio de esporos trazidos, provavelmente, por correntes aéreas transoceânicas que tenham atravessado o Oceano Atlântico, vindos da África. E que essa migração ocorreu mais de uma vez.