História evolutiva de Phakopsora pachyrhizi no Brasil com base em seqüências de nucleotídeos da região espaçadora interna do DNA ribossomal nuclear

Abstract

A soja é atacada por muitos patógenos, porém dentre todas as doenças a ferrugem asiática causada pelo fungo Phakopsora pachyrhizi tem sido considerada como uma das mais importantes. Os sintomas são caracterizados por minúsculos pontos mais escuros do que o tecido sadio, onde se observa uma protuberância, essa se abre em minúsculo poro, expelindo daí, os uredósporo. Plantas severamente infectadas apresentam desfolha precoce, comprometendo a formação e o enchimento de vagens e o peso final dos grãos. O método mais eficiente de controle é o emprego de variedades resistente, entretanto, a grande variabilidade patogênica tem dificultado a pesquisa de tais variedades resistentes. Esse estudo teve como objetivo investigar a distribuição espacial e temporal da atual diversidade genética de Phakopsora pachyrhizi, e inferir sobre as relações evolutivas entre os isolados de origem brasileira e de origem africana e asiática. Uredósporos foram coletados de 20 localidades brasileiras e de localidades na África do Sul. O DNA genômico foi extraído e amplificado por meio de PCR utilizando-se iniciadores específicos para a região de ITS do genoma nuclear de Phakopsora pachyrhizi. As regiões ITS1 e ITS2 foram clonadas e sequenciadas de forma independente. Foram sequenciados quatro clones de cada região ITS por amostra, com o objetivo de verificar se haveria variabilidade do patógeno dentro de uma mesma localidade. As sequências foram alinhadas e comparadas entre si e com sequências de isolados de Phakopsora pachyrhizi de diferentes países obtidas no GenBank. A seguir, o programa TCS foi utilizado para obter redes de haplótipos, uma para as sequências de ITS1, e outra para a região de ITS2. O programa ARLEQUIN foi utilizado para conduzir a análise de variância molecular, calculando a diversidade entre e dentro das localidades amostradas, como também para calcular a diversidade gênica e a diversidade nucleotídica. A rede, com base em sequências provenientes de ITS1, foi capaz de distinguir 21 haplótipos entre as 96 sequências, enquanto que a rede baseada em ITS2 distinguiu 17 haplótipos entre as 86 sequências, indicando que embora P. pachyrhizi tenha sido recentemente introduzida no Brasil, os isolados brasileiros apresentam uma grande variabilidade genética. Essa rede também mostrou que haplótipos amplamente distribuídos no Brasil também foram encontrados na África e Ásia, indicando uma relação de ancestralidade. Pela comparação das sequências, foi observada a presença de cerca de três haplótipos para cada localidade, indicando uma alta diversidade genética dentro da localidade, sendo esse indício comprovado pela análise de variância molecular. Os resultados dão suporte à hipótese de que, a origem desse fungo no Brasil tenha sido por meio de esporos trazidos, provavelmente, por correntes aéreas transoceânicas que tenham atravessado o Oceano Atlântico, vindos da África. E que essa migração ocorreu mais de uma vez.The soybean is attacked by many pathogens, spite of all the diseases the Asiatic rust caused by the fungus Phakopsora pachyrhizi has been considered one of the most important pathogens. The symptoms are characterized for small points darker than the healthy tissue, where it is observed a bulge, which it opens in small pore expelling some uredionospores. Hardly infected plants show premature fallen leave, compromising then the formation and filling of some string beans and also the final weight of some grains. The most effective controlling method is the use of some resistant varieties, however the pathogenic large variability has bothered the research of these resistant varieties. This research has aimed search the special and temporal distribution of the genetic diversity of the Phakopsora pachyrhizi, and infer about the developed relations between some Brazilian, African and Asiatic isolates. Uredionospores were collected in 20 Brazilian places and also in South African. The genomic DNA was extracted from and amplified with the PCR using specifics primers for the ITS region of the nuclear genome in the Phakopsora pachyrhizi. The ITS1 and ITS2 regions were cloned and sequenced of independent forms. Four clones of each ITS regions in samples were sequenced, aimed to verify whether it might have variability of the pathogens in same location. The sequences were lined up and compared each others and also with isolates sequences of the Phakopsora pachyrhizi from different countries in GenBank. Later, the TCS program was used to obtain haplotypes net, one for the ITS1 sequences and other for the ITS2 region. The program ARLEQUIN was used to conduct the analysis of molecular variables, calculating the diversities between and in located samples, and also to calculate the genetic and nucleotide diversity. The net based on the ITS1 sequences, was able to distinguish 21 haplotypes between 96 sequences, while the net based on ITS2 distinguished 17 haplotypes between 86 sequences, showing that spite of Phakopsora pachyrhizi was recently inserted in Brazil, the Brazilian isolates show a great genetic variability. This net shows that distributed haplotypes in Brazil were also found in Africa and Asia, showing an ancestors relation. Comparing the sequences, it was observed the presence of at least three haplotypes for each location, showing a large genetic diversity among the locations, and it was proved by variability molecular analysis. The results support the hypothesis that the origin of this fungus in Brazil has been brought through spores, probably by area transportation through the Atlantic Ocean from Africa and this migration happen more than once.