Efeitos da deleção de APJ1 em leveduras fermentativas em condições de estresse por etanol

Abstract

O bioetanol é o principal biocombustível utilizado mundialmente e é produzido através da fermentação de açúcares por leveduras. A levedura Saccharomyces cerevisiae é a mais utilizada no processo, mas sua incapacidade na fermentação de pentoses levou ao estudo de outras espécies que fermentam pentoses eficientemente, entretanto, estas espécies apresentam baixa tolerância a etanol. Assim, surgiu o interesse de avaliar, em nível de transcriptoma, o papel do silenciamento de APJ1 em S. cerevisiae, e promover sua deleção em Kluyveromyces marxianus, uma vez que trabalhos recentes indicam que sua deleção promoveu aumento da tolerância a etanol. Duas linhagens de S. cerevisiae, BY4741 (wild type) e Y02999 (Δapj1), foram utilizadas para estudo do transcriptoma na presença de 8% (v/v) etanol. Após um período de estresse de duas horas, foram identificados 61 genes up-regulados e 41 genes down-regulados em Y02999. Além destes, 18 genes estavam presentes apenas em Y02999 e 138 genes somente em BY4741. Ao final, oito genes relacionados à tolerância ao etanol e/ou envolvidos com o processo de sumoilação (função relacionada a Apj1p) foram selecionados para validação da diferença de expressão por qPCR, e os genes ARG3 e HSP104 se apresentaram up- regulados e o gene OLE1 se apresentou down-regulado em Y02999 (12% v/v de etanol). Quanto a edição de K. marxianus CCT7735, o sistema CRISPR-Cas9 escolhido para adaptação foi o vetor pML04, desenvolvido para S. cerevisiae. A clonagem do RNA guia neste vetor não ocorreu da forma correta, entrando dois guias no sítio de digestão. Além disso, não foi possível validar a expressão da Cas9 nesta levedura, uma vez que os diferentes primers desenhados para o experimento anelavam de forma inespecífica ao genoma da levedura não transformada. As colônias investigadas por sequenciamento que foram transformadas com esta construção, não apresentaram edição na sequência de APJ1. Apesar do resultado negativo, a ferramenta CRISPR- Cas9 é promissora e cabem mais estudos e ensaios para padronizar a edição em K. marxianus CCT7735.Bioethanol is the most consumed biofuel worldwide and is produced during the fermentation of sugars by yeasts. The yeast Saccharomyces cerevisiae is the most commonly employed organism in this process, however it is incapable of fermenting pentose, which promoted the prospection of other species that could efficiently ferment pentose, although these species present low ethanol tolerance. Therefore, there is increasing interest in the analysis of the role of APJ1 silencing in S. cerevisiae at transcriptome level and in the deletion of this chaperone in Kluyveromyces marxianus, given that recent studies indicate that this deletion resulted in the improvement of ethanol tolerance. Two strains of S. cerevisiae, BY4741 (wild type) and Y02999 (Δapj1), were used for the transcriptome study, in the presence of ethanol 8% (v/v). After a two hours stress period, 61 up-regulated genes and 41 down-regulated genes were found in Y02999. Apart from these genes, 18 were present only in Y02999 and 138 were only in BY4741. Finally, eight genes related to ethanol tolerance and/or involved in the sumoylation process (function related to Apj1p) were selected to differential expression validation through qPCR. Genes ARG3 and HSP104 were up-regulated and OLE1 was down- regulated in Y02999 (12% ethanol v/v). Regarding the K. marxianus CCT7735 edition, the vector pML04, which was developed for use in S. cerevisiae, was the CRISPR-Cas9 adaptation system of choice. The cloning of the RNA guide in this vector did not proceed as expected, since two guiding sequences were inserted in the digestion site. Furthermore, it was not possible to evaluate Cas9 expression in this yeast, once different primers designed for the experiment paired non-specifically with the untransformed yeast genome. The colonies transformed with this construction were analyzed by sequencing and did not present the edition in APJ1 sequence. Despite the negative result, CRISPR- Cas9 is a promising tool and more studies and assays should be done in order to establish a pattern for K. marxianus CCT7735 edition with this system.