Ensaios de interação proteína-proteína revelam funções similares de proteínas em diferentes espécies de plantas e patógenos

Abstract

Raramente, as proteínas funcionam como formas monoméricas e, frequentemente, exercem suas funções como dímeros ou por meio de interações com outras proteínas (heterodímeros ou oligômeros). Estas interações proteína-proteína são particularmente relevantes em vias de sinalização celulares em que os sinais percebidos por receptores são propagados intracelularmente por meio de interações proteína-proteína. A via de sinalização de morte celular mediada por proteínas DCD/NRPs (“Development and Cell Death Domain-containing N-Rich Proteins”) tem sido caracterizada em soja e representa um importante circuito de sinalização que liga senescência foliar natural com aquela induzida por estresses e pode conferir às plantas tolerância à seca. Exceto por GmNAC30 cujo ortólogo de Arabidopsis ainda não foi identificado, os demais componentes da via em soja, NRP-A, NRP-B, GmNAC81, VPE possuem ortólogo caracterizados em Arabidopsis, AtNRP1, AtNRP2, ANAC36 e gamaVPE, respectivamente. GmNAC30 pertence à família SNACA, compartilhando maior grau de conservação de sequência com ATAF2 de Arabidopsis. Sendo assim, o presente estudo propôs investigar, como primeiro objetivo, a possível participação de AtATAF2 na via de morte celular programada mediada por NRPs, como o ortólogo de GmNAC30. Por meio de ensaios de duplo híbrido em leveduras e BiFC em folhas de Nicotiana benthamiana, foi demonstrado que ATAF2 interage com ANAC36 de uma forma específica e, como GmNAC30, também interage com GmNAC81. Estes resultados sugerem que ATAF2 é provavelmente o parceiro natural de ANAC36 na indução da expressão de VPE. Além disso, ATAF2 é localizado no núcleo e exibe atividade transcricional em leveduras, propriedades bioquímicas próprias de GmNAC30. Dentre os patógenos de plantas economicamente importantes, os geminivírus destacam-se por sua ampla ocorrência no mundo e pela variedade de hospedeiros. Begomovírus constitui o maior gênero da família Geminiviridae, cujas espécies são transmitidas pela mosca branca e representam uma restrição severa à agricultura globalmente. Similarmente a outros vírus, os begomovírus formam rede de interações proteína-proteína entre proteínas virais e do hospedeiro. Recentemente, foi identificado o interactoma entre proteínas virais e do hospedeiro, o qual revelou um “hub” de interação proteína-proteína enriquecidos por proteínas que respondem à auxina. Embora estes resultados sugiram que a sinalização por auxina possa ser funcionalmente relevante durante a infecção por begomovírus, é necessário que estas interações sejam comprovadas por métodos alternativos de interação proteína-proteína. Sendo assim foi selecionado um representado do hub AT4G14560 que interage com ambas as proteínas virais NSP e MP a fim de se confirmar estas interações por ensaio de duplo-híbrido em leveduras. Foi demonstrado que AT4G14560 fusionada ao domínio de ativação (AD) de GAL-4 interage com NSP fusionada ao domínio de ligação (BD) de GAL-4, promovendo autotrofia a His quando coexpressas em leveduras. Assim também BD-AT4G14560 interage com AD-MP em leveduras. As interações foram específicas já que as combinações das proteínas fusionadas com vetores vazios não promoveram autotrofia à histidina em leveduras cotransformadas. Estes resultados validam os resultados de arranjo de proteínas e confirmam o possível envolvido de auxina na infecção viral, o que deverá ser investigado posteriormente. Um hub funcional bem definido do sistema imune de plantas corresponde a interconexões convergentes para a proteína CSN5A, para a qual convergem proteínas de patógenos divergentes, como C2 de geminivírus. Este hub também é enriquecido de proteínas de defesa de plantas. Considerando que a proteína AtWWP1 possui atividade antiviral contra geminivírus, foi de interesse verificar a proteína AtWWP1 também faz parte do hub imune derivado de CSN5A. Inicialmente, por meio do sistema duplo-híbrido de leveduras, foi examinada a possível interação das proteínas CSN5A e AtWWP1. A interação entre as respectivas proteínas em leveduras foi confirmada pela ativação do gene repórter LacZ, quantificado pela atividade da enzima β-galactosidase, e autotrofia à histidina em leveduras transformadas com as combinações CSN5A-BD e AtWWP1-AD, mas não em leveduras transformadas pelas combinações com vetores vazios. Além disso, a interação entre as proteínas CSN5A e AtWWP1 foi monitorada in vivo por meio dos ensaios de co- imunoprecipitação e BiFC. Nos experimentos de Co-IP, o anticorpo anti-GFP imunoprecipitou separadamente a proteína CSN5A-GFP e GFP, sendo que a proteína AtWWP1-HA foi detectada somente no imunocomplexo de CSN5A-GFP, confirmando associação estável e específica entre as proteínas AtWWP1 e CSN5A nos extratos protéicos de folhas de N. benthamiana transformadas com as respectivas construções. Nos ensaios de BiFC, coexpressão de AtWWP1 fusionada ao C-terminal de YFP e CSN5A fusionada ao N-terminal de YFP e vice-versa, promoveu a reconstituição de fluorescência no núcleo de células de folhas de N. benthamiana, mas não os controles negativos. Coletivamente, esses resultados demonstram que CSN5A e AtWWP1 interagem in vivo no núcleo de células vegetais. Estes resultados também reforçam o argumento de que o hub imune CSN5A é funcional durante a infecção por geminivírus. Palavras-chave: interação proteína proteína; patógenos de plantas; hub imune CSN5A.

Proteins often function as dimers or interact with other proteins (heterodimers or oligomers) rather than existing as monomers. These protein-protein interactions are crucial in cellular signaling pathways, especially in propagating signals sensed by receptors within cells. One such signaling pathway, mediated by DCD/NRPs proteins, has been studied in soybean. It is an essential circuit connecting natural leaf senescence with stress-induced senescence, potentially contributing to plant drought tolerance. While the Arabidopsis ortholog of GmNAC30 remains unidentified, other components of the soybean pathway (NRP-A, NRP-B, GmNAC81, and VPE) have characterized counterparts in Arabidopsis (AtNRP1, AtNRP2, ANAC36, and gammaVPE, respectively). GmNAC30 belongs to the SNACA family and shares a significant sequence conservation with ATAF2 from Arabidopsis. Therefore, this study aimed to investigate the potential involvement of AtATAF2, as the Arabidopsis counterpart of GmNAC30, in the programmed cell death pathway mediated by NRPs. Through yeast two- hybrid assays and BiFC in Nicotiana benthamiana leaves it was demonstrated that ATAF2 specifically interacts with ANAC36 and also interacts with GmNAC81, similar to GmNAC30. These results suggest that ATAF2 is likely the natural partner of ANAC36 in inducing VPE expression. Furthermore, ATAF2 is located in the nucleus and exhibits unique transcriptional activity in yeast, a distinct biochemical property shared with GmNAC30. Geminiviruses, among economically important plant pathogens, are widespread and infect many hosts. Begomovirus, the largest genus within the Geminiviridae family, is transmitted by whiteflies and poses a significant agricultural constraint globally. Like other viruses, begomoviruses engage in protein-protein interactions with host proteins. Recently, the interactome between viral and host proteins has been identified, revealing a hub of protein-protein interactions enriched with auxin-responsive proteins. Although these findings suggest the functional relevance of auxin signaling during begomovirus infection, alternative protein-protein interaction methods need to be employed for confirmation. Therefore, a representative of the AT4G14560 hub, which interacts with both NSP and MP viral proteins, was selected to validate these interactions using a yeast two-hybrid assay. AT4G14560 fused to the activation domain (AD) of GAL-4 specifically interacted with NSP fused to the binding domain (BD) of GAL-4, leading to histidine autotrophy in co-expressed yeast. Similarly, BD-AT4G14560 interacted with AD-MP in yeast. These interactions were specific as combinations of proteins fused with empty vectors did not promote histidine autotrophy in co-transformed yeasts. These results validate the findings from the protein array and confirm the potential involvement of auxin in viral infection, warranting further investigation. A well-defined functional hub within the plant immune system consists of convergent interconnections involving the CSN5A protein, to which proteins from diverse pathogens such as geminivirus C2 converge. This hub is also enriched with plant defense proteins. Given that the AtWWP1 protein exhibits antiviral activity against geminiviruses, it was of interest to determine if AtWWP1 is part of the CSN5A-derived immune hub. Initially, the yeast two-hybrid system was used to examine the possible interaction between CSN5A and AtWWP1 proteins. The interaction was confirmed by the activation of the LacZ reporter gene, quantified through the activity of the β-galactosidase enzyme, and histidine autotrophy in yeast transformed with the combinations CSN5A-BD and AtWWP1-AD, but not in yeast transformed with combinations involving empty vectors. Furthermore, the interaction between CSN5A and AtWWP1 proteins was validated in vivo using co-immunoprecipitation and BiFC assays. In the co-immunoprecipitation experiments, the anti-GFP antibody successfully immunoprecipitated CSN5A-GFP and GFP proteins separately, and the presence of AtWWP1-HA protein was detected only in the CSN5A-GFP immune complex, confirming a stable and specific association between AtWWP1 and CSN5A in leaf protein extracts of N. benthamiana transformed with the respective constructs. In BiFC assays, co-expression of AtWWP1 fused to the C-terminus of YFP and CSN5A fused to the N-terminus of YFP resulted in fluorescence reconstitution within the nucleus of N. benthamiana leaf cells, whereas negative controls did not produce such fluorescence. Keywords: protein protein interaction; plant pathogens; CSN5A immune hub.