Identification and characterization of CFEM Proteins from Phakopsora pachyrhizi, the Asian soybean rust fungus

Abstract

Asian soybean rust (ASR) caused by the fungus Phakopsora pachyrhizi is one of the main fungal diseases of soybean, which can cause losses of up to 95% of production under favorable environmental conditions and abundant inoculum. This pathogen is an obligate, biotrophic parasite that during the infection process secretes several effector proteins that suppress plant defense responses and promotes parasitism. One of the characteristics of fungal and oomycete effector proteins is the high content of cysteine residues (>3%). CFEM proteins (Common in Several Fungal Extracellular Membrane Proteins) are proteins secreted by different fungi species with a protein domain with 8 cysteine residues in conserved positions and diverse cellular functions. The best characterized CFEM proteins are Csa2, Rbt5, and Pga7 from the fungus Candida albicans, that are involved in a cascade to capture and absorb heme-iron from the mammalian host. The objectives of this study were to identify and characterize all CFEM proteins present in the repertoire of P. pachyrhizi fungus and to understand the biological function of these proteins as membrane component, immunity suppressor or iron capture in the pathogen life cycle. In silico analysis showed that P. pachyrhizi has 10 CFEM proteins (PpCFEM1-PpCFEM10), six of which are predicted to be secreted soluble proteins (PpCFEM1, 5, 7, 8, 9, 10) and four (PpCFEM2, 3, 4, 6) predicted as extracellular proteins with Glycosylphosphatidylinositol (GPI) docking site. Seven of the CFEM protein-coding genes (PpCFEM1-7) were expressed in the period 0 to 96 hours post-inoculation; PpCFEM2, 5, and 6 showed higher expression in the time of zero hours post-inoculation (hpi), and PpCFEM3 and 4 are expressed at 24 hpi. PpCFEM1, 3, 5, and 7 were identified in the nucleus and cytoplasm in subcellular localization assays, PpCFEM2 and PpCFEM6 proteins were identified in the cell membrane, and PpCFEM4 showed no defined subcellular localization. PpCFEM1, 4, 5, and 7 were able to suppress PTI (immunity triggered by recognition of PAPMPs), whereas only the PpCFEM4 protein was also able to suppress ETI (immunity triggered by recognition of effectors) in Nicotiana benthamiana leaves. The PpCFEM proteins did not present homology with the C. albicans CFEM proteins that participate in the heme-iron capture and absorption mechanism, and tertiary structure conformation analyses indicated that the PpCFEM proteins did not present the necessary structure for the heme-iron coordination as present in C. albicans CFEM proteins. Our findings suggest that the PpCFEM1, 4, 5, and 7 proteins can present effector molecule functions, and PpCFEM2, 3, and 6 proteins could present structural functions in the cellular process that occurs at the beginning of the infectious process. CFEM-based heme-iron capturing and absorption mechanism in P. pachyrhizi was not observed. Keywords: CFEM proteins. Phakopsora pachyrhizi. Functional characterizationA ferrugem asiática da soja (FAS) causada pelo fungo Phakopsora pachyrhizi é uma das principais doenças fúngicas da cultura da soja, podendo causar perdas de até 95% da produção em condições de ambiente favorável e inóculo abundante. Este patógeno é um parasita obrigatório, biotrófico, que durante o processo de infecção, secreta diversas proteínas efetoras que suprimem as respostas de defesa da planta e promovem o parasitismo. Uma das características de proteínas efetoras de fungos e oomicetos é o elevado conteúdo de resíduos de cisteína (>3%). As proteínas CFEM (Common in Several Fungal Extracellular Membrane Proteins) são proteínas secretadas por diferentes espécies de fungos que possuem um domínio proteico com 8 resíduos de cisteína em posições conservadas, e apresentam funções celulares diversas. As proteínas CFEM melhor caracterizadas são Csa2, Rbt5 e Pga7 do fungo Candida albicans envolvidas em uma cascata de captura e absorção de moléculas de ferro-heme a partir do hospedeiro. Os objetivos deste estudo foram identificar e caracterizar todas as proteínas CFEM presentes no repertório do fungo P. pachyrhizi e entender a função biológica dessas proteínas como componente de membrana, supressor de imunidade ou captura de ferro no ciclo de vida do patógeno. Análises in sílico revelaram que P. pachyrhizi possui 10 proteínas CFEM (PpCFEM1-PpCFEM10), sendo seis delas preditas como proteínas secretadas solúveis (PpCFEM1, 5, 7, 8, 9, 10) e quatro (PpCFEM2, 3, 4, 6) preditas como proteínas extracelulares com predição de sítio de adição de âncora de glicosilfosfatidilinositol (GPI). Sete dos genes codificadores de proteínas CFEM (PpCFEM1-7) foram expressos no período de 0 a 96 horas pós-inoculação, PpCFEM2, 5 e 6 apresentam maior expressão no tempo de zero horas após inoculação (hpi) e PpCFEM3 e 4 são expressos em 24 hpi. As proteínas PpCFEM1, 3, 5, e 7 foram identificadas no núcleo e citoplasma celular em ensaios de localização subcelular, as proteínas PpCFEM2 e PpCFEM6 foram identificadas na membrana celular, e PpCFEM4 não apresentou localização subcelular definida. PpCFEM1, 4, 5 e 7 foram capazes de suprimir PTI (imunidade desencadeada pelo reconhecimento de PAMPs), e apenas a proteína PpCFEM4 foi capaz de suprimir ETI (imunidade desencadeada pelo reconhecimento de efetores) em folhas de Nicotiana benthamiana. A expressão e função dos genes Pp-CFEM 8 a 10 não foi analisada. As proteínas PpCFEM não apresentaram homologia com as proteínas CFEM de C. albicans que participam do mecanismo de captura e absorção do ferro heme, e análises de conformação de estrutura terciária indicaram que as proteínas PpCFEM não apresentaram a estrutura necessária para a coordenação ferro-heme como presentes em proteínas CFEM de C. albicans. Os resultados sugerem que as proteínas PpCFEM1, 4, 5 e 7 apresentam funções de moléculas efetoras, e as proteínas PpCFEM2, 3 e 6 podem apresentar funções estruturais em processos celulares que ocorre no início do processo infeccioso. Palavras-chave: Proteínas CFEM. Phakopsora pachyrhizi. Caracterização funcional.