Sequenciamento do genoma de Colletotrichum lindemuthianum e identificação de genes candidatos a efetores

Abstract

Colletotrichum é um gênero de fungo que compreende centenas de espécies amplamente distribuídas pelo mundo. Muitas dessas espécies além de serem fitopatógenos de grande importância econômica, representam modelos para a identificação de genes relacionados com a patogenicidade e virulência de patógenos hemibiotróficos. Apesar disso, até o momento, poucos genomas de espécies de Colletotrichum foram sequenciados e anotados. Colletotrichum lindemuthianum, agente causal da antracnose no feijoeiro comum (Phaseolus vulgaris), adota um estilo de parasitismo hemibiotrófico durante a infecção do feijoeiro e representa um dos grupos de patógenos mais devastadores para essa cultura. Neste trabalho é reportado o sequenciamento do genoma nuclear e a anotação e análise do genoma mitocondrial de dois isolados de C. lindemuthianum (83.501 e 89 A2 2-3). Além disso, realizou-se a predição in silico dos genes relacionados ao repertório de proteínas candidatas à efetoras no genoma nuclear de dez espécies de Colletotrichum, incluindo C. lindemuthianum. Os genomas nucleares dos isolados de C. lindemuthianum possuem um tamanho total de 97,4 Mb (83.501) e 99,16 Mb (89 A 2 2-3), sendo até o momento os maiores genomas de espécies de Colletotrichum já sequenciados, e codificam um total de 11.627 (89 A2 2-3) e 11.673 (83.501) proteínas. Os tamanhos dos genomas mitocondriais foram 37.440 pb (83.501) e 37.446 pb (89 A2 2-3). A diferença de seis nucleotídeos entre os dois genomas é o resultado de uma deleção no gene rps3 no isolado 83.501 e foi observada uma troca de adenina por guanina na posição 3.457 no genoma mitocondrial do isolado 83.501, dentro do gene rps3 (proteína ribosomal S3). Ambos possuem um total de 53 genes, incluindo genes que codificam proteínas, RNAs transportadores, RNAs ribossomais e open reading frame não conservadas (ncORF). O genoma mitocondrial de C. lindemuthianum foi comparado com os genomas mitocondriais de sete espécies do gênero pertencentes aos clados acutatum, graminicola, orbiculare e gloeosporioides. Quatorze genes core mitocondriais em Colletotrichum spp. não apresentam sintenia. As ncORF variam em número e são codificadas por ambas as fitas. As regiões intergênicas possuem tamanho similares, exceto nas espécies do clado gloeosporioides, e o número de introns foi altamente variável e codificam um total de até nove endonucleases homing. A variação no tamanho dos genomas mitocondriais é devida principalmente as ncORF e introns do grupo I. O total de genes candidatos a efetores preditos a partir da montagem dos genomas nucleares em ambos isolados de C. lindemuthianum foi de 324. Entre as nove espécies analisadas, o total variou de 247 em Colletotrichum graminicola até 446 em Colletotrichum orbiculare. A maioria das sequências de aminoácidos codificados pelos genes candidatos à efetores (até 91,4% no caso de Colletotrichum fioriniae) apresentou homologia com proteínas não caracterizadas. Um total de 28 grupos de sequências de aminoácidos (total de 43 sequências de aminoácidos) codificadas por genes candidatos a efetores em C. lindemuthianum possuem sequências homólogas em todas as outras nove espécies de Colletotrichum. Foram encontrados 12 domínios conservados em todas as 10 espécies. Foram identificados também sequências de aminoácidos com presença de domínios conservados ainda não relatado para proteínas efetoras de Colletotrichum spp., o que permitiu sugerir papeis putativos para essas efetoras. A transcrição de seis genes candidatos a efetores de C. lindemuthianum foi avaliada por meio de Real- time RT-PCR. Todos os genes selecionados tiveram o mesmo padrão de expressão, sendo maior na fase biotrófica de crescimento do fungo no feijoeiro. Este trabalho disponibiliza informações importantes que podem auxiliar a compreensão da biologia e das estratégias de infecção utilizadas por espécies do gênero Colletotrichum.

Colletotrichum is a genus of fungus that comprises hundreds of species widely distributed throughout the world. Many of these species, besides being phytopathogens of great economic importance, represent models for the identification of genes related to the pathogenicity and virulence of hemibiotrophic pathogens. Despite this, to date, few genomes of Colletotrichum species have been sequenced and annotated. Colletotrichum lindemuthianum, the causal agent of anthracnose in common bean (Phaseolus vulgaris), adopts a style of hemibiotrophic parasitism during bean infection and represents one of the most devastating groups of pathogens for this crop. In this work, we report the sequencing of the nuclear genome and the annotation and analysis of the mitochondrial genome of two isolates of C. lindemuthianum (83.501 and 89 A2 2-3). In addition, in silico prediction of genes related to the repertoire of effector candidate proteins in the nuclear genome of ten Colletotrichum species, including C. lindemuthianum, was performed. Nuclear genomes of C. lindemuthianum isolates have a total size of 97.4 Mb (83.501) and 99.16 Mb (89 A2 2-3), and the largest genomes of Colletotrichum species have been sequenced to date and encode one total of 11,627 (89 A2 2-3) and 11,673 (83,501) proteins. The sizes of the mitochondrial genomes were 37,440 bp (83,501) and 37,446 bp (89 A2 2-3). The difference of six nucleotides between the two genomes is the result of a deletion in the rps3 gene in the 83501 isolate and an adenine exchange for guanine at position 3,457 was observed in the mitochondrial genome of the 83,501 isolate within the rps3 gene (ribosomal protein S3). Both have a total of 53 genes, including genes encoding uncorrected proteins, transporter RNAs, ribosomal RNAs and open reading frame (ncORF). The mitochondrial genome of C. lindemuthianum was compared to the mitochondrial genomes of seven species of the genus belonging to the clades acutatum, graminicola, orbiculare and gloeosporioides. Fourteen mitochondrial core genes in Colletotrichum spp. They do not have synteny. The ncORFs vary in number and are encoded by both strand. The intergenic regions have similar size, except in the gloeosporioid clade species, and the number of introns was highly variable and encode a total of up to nine homing endonucleases. The variation in the size of mitochondrial genomes is mainly due to ncORF and type I introns. The total of effector candidate genes predicted from the assembly of nuclear genomes in both C. lindemuthianum isolates was 324. Among the nine species analyzed, the total ranged from 247 in Colletotrichum graminicola to 446 in Colletotrichum orbiculare. Most of the amino acid sequences encoded by the effector candidate genes (up to 91.4% in the case of Colletotrichum fioriniae) showed homology with uncharacterized proteins. A total of 28 groups of amino acid sequences (total of 43 amino acid sequences) encoded by effector candidate genes in C. lindemuthianum have homologous sequences in all nine other Colletotrichum species. We found 12 conserved domains in all 10 species. It was also identified amino acid sequences with presence of conserved domains not yet reported for effectors of Colletotrichum spp., which allowed to suggest putative roles for these effectors. The expression of six candidate genes for effectors of C. lindemuthianum was evaluated by means of Real-time RT- PCR. All selected genes had the same expression pattern, being higher in the biotrophic phase of fungus growth in common bean. This work provides important information that can help to understand the biology and infection strategies used by species of the genus Colletotrichum.