Influência da glicose na regulação do metabolismo de xilose em Spathaspora passalidarum

Abstract

A levedura Spathaspora passalidarum possui grande potencial de converter glicose e xilose de materiais lignocelulósicos em bioetanol. No entanto, essa levedura utiliza esses açúcares de forma sequencial, sendo a glicose consumida preferencialmente em relação à xilose. O presente trabalho buscou identificar as principais formas que glicose interfere no metabolismo de xilose em S. passalidarum. Primeiramente foi avaliado a influência da glicose no consumo de xilose, produção de etanol, expressão de genes e atividade das enzimas chave para assimilação de xilose, em condições de aeração e de limitação de oxigênio. Os principais resultados obtidos mostram que a glicose inibe o consumo de xilose dessa levedura, independente da condição de oxigenação e da sua concentração extracelular. Os genes que codificam as enzimas xilose redutase (XR), xilose desidrogenase (XDH) e xiluloquinase (XK) foram menos expressos quando glicose estava presente no meio, indicando a ocorrência de repressão por glicose no metabolismo de xilose. Porém, testes de crescimento utilizando o análogo de glicose 2-deoxiglicose (2DG) revelaram a ausência de repressão catabólica, embora a 2DG atrase o consumo de xilose quando presente no meio. Assim, é possível que a interferência da glicose no metabolismo da xilose de S. passalidarum possa estar ocorrendo a nível de transporte. Para entender a influência da glicose no transporte de xilose primeiramente identificamos potenciais transportadores de glicose e xilose no genoma dessa levedura. O perfil de expressão dos genes que codificam os potenciais transportadores, sugere que essa levedura possui vias de detecção e regulação transcricional de transportadores de açúcares. Para caracterização funcional, quatro prováveis transportadores foram selecionados e expressos na linhagem de S. cerevisiae DGLK1. Essa linhagem possui a deleção dos principais transportadores de hexose (hxt1-hxt7 e gal2) e, portanto, somente será capaz de crescer em meio contendo glicose ou xilose como fonte de carbono, através da expressão de um transportador heterólogo. Apenas um dos transportadores testados foi capaz de restaurar o crescimento de S. cerevisiae DGLK1 em meio sólido com xilose ou glicose. A estrutura proteica deste alvo é característica de um transportador de açúcar e as análises de docking mostraram que a glicose tem maior afinidade de ligação a esse transportador, comparado à xilose e 2DG. Dessa forma, sugerimos que a glicose interfere no metabolismo de xilose através da inibição do transporte de xilose, por meio da competição pelo mesmo transportador. Além disso, a glicose controla, por mecanismos ainda desconhecidos, a expressão dos genes que codificam os transportadores de açúcares e os genes das principais enzimas do metabolismo da xilose. Assim, estes pontos de regulação precisam ser investigados e contornados para obter a máxima eficiência no consumo simultâneo destes açúcares por S. passalidarum. Palavras-chave: Spathaspora passalidarum. Cofermentação. Repressão por glicose

The yeast Spathaspora passalidarum presents great potential to converst glucose and xylose from lignocellulosic materials into bioethanol. However, this yeast uses these sugars sequentially, with glucose being preferably consumed than xylose. The present work sought to identify the main ways that glucose interferes with the xylose metabolism of S. passalidarum. First, the influence of glucose on xylose consumption, ethanol production, gene expression, and activity of key enzymes involved in xylose assimilation were evaluated under aeration and oxygen limitating conditions. The main results show that glucose inhibits xylose consumption regardless of the oxygen condition and extracellular concentration of glucose. The genes encoding the enzymes xylose reductase (XR), xylose dehydrogenase (XDH), and xylulokinase (XK) were less expressed when glucose was present in the medium, suggesting the occurrence of glucose repression on xylose metabolism. However, growth tests using the glucose analog 2-deoxyglucose (2DG) revealed the absence of catabolic repression, even though 2DG delayed the consumption of xylose when present in the medium. Thus, it is possible that the glucose interference on the xylose metabolism of S. passalidarum may occur at the transport level. To understand the influence of glucose on xylose transport, we first identified potential glucose and xylose transporters in the genome of this yeast. The expression profile of these putative transporter genes suggests that S. passalidarum presents pathways that detect and transcriptionally regulate the expression of sugar transporters. For the functional characterization assay, four putative transporters were selected and expressed in S. cerevisiae DGLK1. This strain has the main hexose transporters (hxt1-hxt7 and gal2) deleted from its genome, and therefore, it is only able to grow in a medium containing glucose or xylose as carbon sources through the expression of heterologous transporters. Only one of the evaluated transporters restored the growth of S. cerevisiae DGLK1 on solid media supplemented with xylose or glucose. The protein structure of this target is characteristic of a sugar transporter, and the docking analyzes showed that glucose has a higher binding affinity for this transporter than xylose and 2DG. Thus, we suggest that glucose interferes with xylose metabolism by inhibiting xylose transport through competition for the same sugar transporter. In addition, glucose controls the expression of genes encoding sugar transporters and the main enzymes of xylose metabolism by yet unknown mechanisms. Thus, these regulatory points need to be investigated and bypassed to obtain maximum efficiency in the simultaneous consumption of these sugars by S. passalidarum. Keywords: Spathaspora passalidarum. Co-fermentations. Glucose repression