Effects of probiotic VSL#3 and synbiotic VSL#3 associated with yacon- based product (PBY) on gut microbiota and on the development of intestinal diseases in mice

Abstract

Intestinal diseases, including colorectal cancer (CRC) and inflammatory bowel diseases (IBD) have high prevalence and mortality rates worldwide. Although there is a genetic component associated with the etiology of these diseases, the participation of environmental and lifestyle-related factors in their development has been increasingly demonstrated. Changes in the composition and activity of the intestinal microbiota, which may be associated, for example, with inadequate feeding, seem to contribute to the increased risk of development of both CRC and IBD. Thus, it is increasing and justifiable the search for food or no-food compounds, that can reestablish the balance of the microbiota and modify the intestinal microenvironment, reducing the risk of diseases. The use of probiotics and prebiotics, isolated or combined (synbiotic), is one of the main strategies for targeted modulation of the microbiota, either by adding specific microorganisms or by conferring a selective advantage on resident microorganisms. The general objective of this study was to investigate the effects of probiotic VSL#3 and synbiotic VSL#3 associated with yacon- based product (PBY), on the modulation of the gut microbiota and its influence on the development of precursor lesions of CRC and on the manifestations of colitis- associated carcinogenesis (CAC). For this, two distinct experiments were conducted: in Experiment 1, wild C57BL6/J mice received, for 13 consecutive weeks, the probiotic multispecies VSL#3 isolated (probiotic group - PRO) or associated with PBY (synbiotic group - SYN) and were induced to colorectal carcinogenesis with 1,2- dimethylhydrazine (DMH). In Experiment 2, knockout mice for interleukin-10 (IL-10 -/- ), a spontaneous colitis model, were induced to carcinogenesis with DMH and received the synbiotic VSL#3 + PBY for the same period. In Manuscript 1 (Published) (Experiment 1), our aim was to evaluate the effects of probiotic and synbiotic on the composition of the intestinal microbiota and their influence on the development of precursor lesions of CRC. It was observed that both the use of probiotic and synbioticmodified the composition of the microbiota; changes in the microbiota of the control group were also observed, confirming that carcinogenesis itself alters the resident microbial community. The precursor lesions of CRC were significantly reduced in the SYN group, but not in the PROCiência da Nutrição group. This outcome is possibly associated with changes in the intestinal microenvironment induced by microbiota modulation in the SYN group, such as significant reduction of inflammatory response in the colon, reduction of the activity of the pro-carcinogenic enzyme -glucuronidase, and increase in short-chain fatty acids (SCFA). Manuscript 2 (Published) (Experiment 1) sought to investigate possible mechanisms of action associated or that could explain the results obtained in Article 1. Thus, the effects of probiotic and synbiotic on oxidative stress and intestinal permeability were investigated. Probiotic and synbiotic have antioxidant activity in vitro. Both PRO and SYN groups had lower concentrations of oxidation products, manlondialdehyde and protein carbonyl, compared to the control group. The activity of the antioxidant enzyme catalase was higher in the SYN group compared to the others. It was also observed an increase in the depth crypts in the PRO and SYN groups, which corroborates the reduction in intestinal permeability (measured by urinary lactulose excretion) in these groups. Manuscript 3 (Submitted) (Experiment 1) evaluated the effect of probiotic and synbiotic on the functional metabolic pathways of the microbiota and on the expression of genes associated with colorectal carcinogenesis. The SYN group showed a highly differentiated intestinal community based on the MetaCyc pathways. Of the 351 predicted functional pathways, 222 differed between groups. Most of them were enriched in the SYN group, namely: amino acid biosynthesis pathways, small molecule biosynthesis pathways, carbohydrate degradation pathways, and fermentation pathways. In addition, synbiotic was able to stimulate the anti-inflammatory immune response and reduce gene expression of PCNA and c-myc. As demonstrated in these studies, the use of the synbiotic VSL#3 + PBY significantly reduced the incidence of precursor lesions of CRC and down- regulated the expression of genes associated with carcinogenesis. We believe that these findings are the result of the synbiotic influence on the composition and activity of the intestinal microbiota, notably through reduced inflammatory response, improved oxidative stress, reduced pro-carcinogenic enzyme activity, increased SCFA and reduced permeability intestinal. Manuscript 4 (Published) (Experiment 2) aimed to evaluate the effect of the synbiotic VSL#3 + PBY in a colitis-associated carcinogenesis (CAC) model. Preservation of intestinal architecture, increased activity of antioxidantenzymes superoxide dismutase and catalase, and AGCC concentrations, especially butyrate, were observed. Regarding the composition of the intestinal microbiota, we highlight that the microbiota of the experimental model used was characterized by a restricted biodiversity, with a limited number of bacterial genera representing the total microbial community. This finding has been consistently demonstrated in cases of cancer in experimental models and in humans, and in IBD patients. In Manuscript 5 (Submission process) (Experiment 2), we investigate the effects of the synbiotic VSL#3 and PBY on the intestinal inflammatory response, expression of genes associated with colorectal carcinogenesis, β-glucuronidase enzyme activity, functional metabolic pathways of the microbiota, and production of fecal fatty acids. Lower expression of p53 and c-myc in the synbiotic group compared to control group was observed. Similarly, IL-17 levels were also lower. There was also an increase in IL-4 in the synbiotic group compared to negative control. The principal component analysis revealed a poorly differentiated intestinal community based on MetaCyc pathways. These findings support the similarity in predicted metabolic pathways between groups. There was also a reduction in the activity of the -glucuronidase enzyme and an increase in short-chain fatty acids in the synbiotic group. Thus, it is suggested that the synbiotic could be a novel potential health-protective natural agent against CAC. Keywords: Colorectal cancer. Inflammatory bowel disease. Gut microbiota. Probiotic. Prebiotic. Synbiotic.

As doenças intestinais, dentre elas o câncer colorretal (CCR) e as doenças inflamatórias intestinais (DII), apresentam altas taxas de prevalência e mortalidade no mundo. Embora exista um componente genético associado à etiologia dessas enfermidades, cada vez mais tem sido demonstrada a participação de fatores ambientais e relacionadas ao estilo de vida no desenvolvimento das mesmas. As alterações na composição e na atividade da microbiota intestinal, que podem estar associadas, por exemplo, à alimentação inadequada, parecem contribuir para o aumento do risco de desenvolvimento tanto do CCR quanto das DII. Assim, é crescente e justificável a busca por compostos alimentares ou não, que possam reestabelecer o equilíbrio da microbiota e modificar o microambiente intestinal, reduzindo o risco de doenças. O uso de probióticos e prebióticos, isolados ou combinados (simbiótico), é uma das principais estratégias de modulação direcionada da microbiota, seja pela adição de microrganismos específicos ou por conferir vantagem seletiva aos microrganismos residentes. O objetivo geral deste estudo foi investigar os efeitos do probiótico VSL#3 e do simbiótico VSL#3 associado ao produto à base de yacon (PBY), na modulação da microbiota intestinal e sua influência no desenvolvimento de lesões precursoras do CCR e nas manifestações da carcinogênese associada à colite (CAC). Para isso, foram conduzidos dois experimentos distintos: no Experimento 1, camundongos C57BL6/J selvagens receberam, por 13 semanas consecutivas, o probiótico multiespécies VSL#3 isolado (grupo probiótico - PRO) ou associado ao PBY (grupo simbiótico - SYN) e foram induzidos à carcinogênese colorretal com 1,2-dimetilhidrazina (DMH). Já no Experimento 2, camundongos nocautes para interleucina-10 (IL-10-/-), um modelo de colite espontânea, foram induzidos à carcinogênese com DMH e receberam o simbiótico VSL#3 + PBY pelo mesmo período. No Artigo 1 (Publicado) (Experimento1), nosso objetivo foi avaliar os efeitos do probiótico e do simbiótico na composição da microbiota intestinal e sua influência no desenvolvimento de lesões precursoras do CCR. Foi observado que, tanto o uso do probiótico quanto do simbiótico modificaram a composição da microbiota; também foram observadas modificações na microbiota do grupo controle, confirmando que a carcinogênese em si altera a comunidade microbiana residente. As lesões precursoras do CRC foram reduzidas significativamente no grupo SYN, mas não no grupo PRO. Esse desfecho possivelmente está associado às modificações no microambiente intestinal, induzidas pela modulação da microbiota no grupo SYN, como a redução significativa da resposta inflamatória no cólon, a redução da atividade da enzima pró-carcinogênica - glucuronidase, e o aumento dos ácidos graxos de cadeia curta (AGCC). O Artigo 2 (Publicado) (Experimento 1) buscou averiguar possíveis mecanismos de ação associados ou que pudessem explicar os resultados obtidos no Artigo 1. Assim, foram investigados os efeitos do probiótico e do simbiótico no estresse oxidativo e na permeabilidade intestinal. Foi demonstrado que o probiótico e o simbiótico possuem atividade antioxidante in vitro. Ambos os grupos PRO e SYN apresentaram menores concentrações dos produtos de oxidação, malondialdeído (MDA) e proteína carbonilada (PC), comparados ao grupo controle. A atividade da enzima antioxidante catalase (CAT) foi maior no grupo SYN comparado ao demais. Observou-se ainda, aumento da profundidade das criptas intestinais nos grupos PRO e SYN, o que corrobora a redução da permeabilidade intestinal (medida pela excreção de lactulose urinária) nesses grupos. No Artigo 3 (Submetido) (Experimento 1) foi avaliado o efeito do probiótico e do simbiótico nas vias metabólicas funcionais da microbiota e na expressão de genes associados à carcinogênese colorretal. O grupo SYN apresentou a comunidade intestinal altamente diferenciada com base nas vias MetaCyc. Das 351 vias funcionais previstas, 222 diferiram entre os grupos, sendo a maioria enriquecidas no grupo SYN, a saber: vias de biossíntese de aminoácidos, vias de biossíntese de pequenas moléculas, vias de degradação de carboidratos e vias de fermentação. Além disso, o simbiótico foi capaz de estimular a resposta imune anti-inflamatória e reduzir a expressão gênica de PCNA e c-myc. Como demonstrado nestes estudos, o uso do simbiótico VSL#3 + PBY reduziu significativamente a incidência de lesões precursoras do CCR e regulou negativamente a expressão de genes associados à carcinogênese. Acreditamos que esses achados sejam resultantes da influência do simbiótico sobre a composição e a atividade da microbiota intestinal, notavelmentepor meio da redução da resposta inflamatória, melhora do estresse oxidativo, redução da atividade de enzima pró-carcinogênica, aumento dos AGCC e redução da permeabilidade intestinal. O Artigo 4 (Publicado) (Experimento 2), teve como objetivo avaliar o efeito do simbiótico VSL#3 + PBY em um modelo de carcinogênese associado à colite (CAC). Foi observado a preservação da arquitetura intestinal, o aumento da atividade das enzimas antioxidantes SOD e CAC, e das concentrações dos AGCC, especialmente o butirato. Em relação à composição da microbiota intestinal, destacamos que o modelo experimental utilizado foi caracterizado por uma biodiversidade restrita, com um número limitado de gêneros bacterianos representando a comunidade microbiana total. Este achado é consistentemente demonstrado em casos de câncer em modelos experimentais e em humanos, e em pacientes com DII. No Artigo 5 (Em processo de submissão) (Experimento 2), investigamos os efeitos do simbiótico VSL # 3 e PBY na resposta inflamatória intestinal, na expressão de genes associados à carcinogênese colorretal, na atividade da enzima β-glucuronidase, nas vias metabólicas funcionais da microbiota e na produção de ácidos graxos fecais. Foi observada menor expressão de p53 e c-myc no KOSYN em comparação com o grupo controle. Da mesma forma, os níveis de IL- 17 também foram menores. Houve um aumento de IL-4 no KOSYN em comparação com o controle negativo. A análise de componentes principais revelou uma comunidade intestinal pouco diferenciada com base nas vias MetaCyc. Esses achados corroboram a similaridade nas vias metabólicas preditas entre os grupos. Também houve redução da atividade da enzima -glucuronidase e aumento dos AGCC no grupo simbiótico. Assim, sugere-se que o simbiótico pode ser um novo agente natural potencial protetor da saúde contra o CAC. Palavras-chave: Cancer colorretal. Doença inflamatória intestinal. Microbiota intestinal. Probiótico. Prebiótico. Simbiótico.