Transcriptional modulation and characterization of plant-specific trans-acting factors in abiotic stress responses

Abstract

Transcription factors (TFs) are key regulators of gene expression in cells. Due to their functional plasticity and their role as pivotal players in controlling gene expression according to the environment, they may be considered hot spots to decipher the mechanisms of plant responses to multiple stresses and suitable targets for biotechnological intervention and development of adapted plants. Several plant TF families have been implicated in stress responses, including NAC, MYB, WRKY, and bZIP. The present work explores the functionality of Arabidopsis AREB-1, a well- characterized bZIP TF in drought stress response and physiological adaptation, and the soybean NAC superfamily and members associated with the control of multiple stress responses and senescence. In the first chapter, we introduced a new strategy of transcription modulation of AREB-1 by CRISPR/dCas9 in Arabidopsis for tolerance to drought. The following chapters deal with new insights toward GmNAC superfamily and functional studies of GmNAC065 and GmNAC085 based on genome- and transcriptome-wide analyses in soybean and a reverse genetics approach in Arabidopsis. Using the CRISPR activation (CRISPRa) technique, an inactive nuclease dCas9 was fused with a histone acetyl-transferase 1 (AtHAT1), optimizing gene expression via chromatin remodeling. The CRISPRa-mediated AREB1 overexpression promoted an improvement in the physiological performance of the transgenic plants under 30 days of water deprivation. The enhanced drought tolerance phenotype was associated with increased chlorophyll content, antioxidant enzyme activity, and soluble sugar content, with consequent lower reactive oxygen species (ROS) accumulation. Finally, we demonstrated that the up-regulation of AREB1 positively changed the transcription of downstream ABA-inducible genes involved in adaptive response and promoted a better plant performance under drought, validating CRISPRaas a biotechnological tool to improve specific plant traits.The NAC genes encode TFs involved in the control of plant morph-physiology and stress responses. The last soybean genome assembly (Wm82.a2.v1) raised the possibility of new NAC genes onthe soybean genome. In thisinvestigation, we identified 32 putative novel NAC genes, updating the superfamily to 180 gene members, clustered in15 phylogenetic subfamilies. We showed that 40% of the GmNACsare differentially regulated by developmental senescence. GmNAC065 and GmNAC085 display contrasting gene expression profiles in multiple stress responses and induce symptoms of leaf senescence to a different extent when transiently expressed in N. benthamiana, suggesting a divergent role of these genes. Subsequently, the soybean genome was interrogated for developmental and environmental senescence- associated genes (SAGs) belonging to the NAC superfamily. Using functionally characterized Arabidopsis SAGs as prototypes, we identified the putative NAC-SAGs in soybean, including GmNAC065 and GmNAC085, whose functions in multiple stress responses and senescence were further investigated in soybean and Arabidopsis transgenic lines. The ectopic expression of GmNAC065 in Arabidopsis leads to a delayed-senescence phenotype, with enhanced oxidative performance under multiple stresses and lower stress-induced PCD. The GmNAC085-expressing lines displayed an opposite phenotype leading to the up-regulation of several downstream SAGs in Arabidopsis, further demonstrating their divergent roles in stress responses and PCD. Finally, if we are to use soybean as a model system for genetic studies and development of new cultivars, we need to develop an efficient protocol for soybean transformation and regeneration. The final chapter of this work proposes a new methodology for soybean genetic transformation combining biolistic and Agrobacterium-mediated DNA delivery. We developed a one-step protocol for transgenic soybean recovery in approximately 30 - 40 weeks more cost-effectively and straightforwardly exploring the high regenerative capacity of shoot-apex cells in the embryonic axis. The protocol allows the direct co-cultivation and plant regeneration, avoiding contamination generated by excessive tissue-manipulation, demanded in other protocols. Therefore, we are now better positioned to translate the fundamental studies developed in this investigation into biotechnological traits to get superior crops. Keywords: Trans-acting factors. Modern crop breeding. Environmental stresses. Senescence. Plant genetic engineering.

Fatores de transcrição (FTs) são reguladores centrais da expressão gênica nas células. Devido à sua plasticidade funcional e ao seu papel como protagonistas no controle da expressão gênica de acordo com o ambiente, podem ser considerados hot spots para decifrar os mecanismos de resposta das plantas a múltiplos estresses e alvos adequados para intervenção biotecnológica e desenvolvimento de plantas adaptadas. Diversas famílias de fatores de transcrição de plantas são relacionados as respostas ao estresse, incluindo NAC, MYB, WRKY e bZIP. O presente trabalho explora a funcionalidade de AREB-1, um FT da família bZIP em Arabidopsis, extensivamente caracterizado caracterizado nas adaptações fisiológicas em resposta ao estresse hídrico, além da superfamília NAC de soja e seus membros associados ao controle de respostas múltiplas ao estresse e senescência. No primeiro capítulo, apresentamos uma nova estratégia de modulação da transcrição de AREB-1 por CRISPR/dCas9 em Arabidopsis para tolerância à seca. Os capítulos a seguir lidam com novas idéias acerca da superfamília GmNAC e estudos funcionais de GmNAC065 e GmNAC085 com base em análises genômicas e transcritômicas, além de uma abordagem de genética reversa em Arabidopsis. Utilizando a técnica de ativação CRISPR (CRISPRa), uma nuclease inativa dCas9 foi fundida com uma histona acetil-transferase 1 (AtHAT1), otimizando a expressão gênica via remodelação da cromatina. A superexpressão de AREB1 mediada por CRISPRa promoveu uma melhora no desempenho fisiológico das plantas transgênicas em 30 dias de privação de água. O fenótipo de maior tolerância à seca foi associado ao aumento do conteúdo de clorofila, atividade de enzimas antioxidantes e conteúdo de açúcar solúvel, com consequente menor acúmulo de espécies reativas de oxigênio (EROS). Finalmente, demonstramos que a regulação positiva de AREB1 alterou positivamente a transcrição de genes induzíveis ABA downstream envolvidos na resposta adaptativa e promoveu um melhor desempenho da planta sob seca, validando o CRISPRa como uma ferramenta biotecnológica para melhorar características específicas desejáveis em plantas. Os genes NAC codificam TFs envolvidos no controle damorfofisiologia da planta e respostas ao estresse. A última montagem do genoma da soja (Wm82.a2.v1) levantou a possibilidade de novos genes NAC no genoma da soja. Nesta investigação, identificamos 32 novos genes NAC putativos, atualizando a superfamília para 180 membros de genes, agrupados em 15 subfamílias filogenéticas. Mostramos que 40% dos GmNACs são regulados diferencialmente pela senescência do desenvolvimento. GmNAC065 e GmNAC085 apresentam perfis de expressão gênica contrastantes em múltiplas respostas de estresse e induzem sintomas de senescência foliar em diferentes extensões quando expressos transientemente em N. benthamiana, sugerindo um papel divergente para esses genes. Posteriormente, o genoma da soja foi interrogado para genes associados à senescência desencadeada por estresse e de desenvolvimento (SAGs) pertencentes à superfamília NAC. Usando SAGs de Arabidopsis funcionalmente caracterizados como protótipos, identificamos os NAC- SAGs putativos em soja, incluindo GmNAC065 e GmNAC085, cujas funções em múltiplas respostas ao estresse e senescência foram investigadas em soja e linhagens transgênicas de Arabidopsis. A expressão ectópica de GmNAC065 em Arabidopsis leva a um fenótipo de senescência retardada, com desempenho oxidativo aprimorado sob estresse múltiplo e menor morte celular induzida por estresse. As linhas que expressam GmNAC085 exibiram um fenótipo oposto levando à regulação positiva de vários SAGs, reforçando ainda mais seus papéis divergentes nas respostas ao estresse e morte celular programada. Finalmente, se quisermos usar a soja como sistema modelo para estudos genéticos e desenvolvimento de novas cultivares, precisamos desenvolver um protocolo eficiente para a transformação e regeneração da soja. O capítulo final deste trabalho propõe uma nova metodologia para a transformação genética da soja combinando a biolística e a transformação mediada por Agrobacterium. Desenvolvemos um protocolo de uma etapa para a recuperação da soja transgênica em aproximadamente 30 a 40 semanas de maneira mais econômica e explorando de forma direta a alta capacidade regenerativa das células do meristema apical no eixo embrionário. O protocolo permite o co-cultivo direto e a regeneração da planta, evitando a contaminação gerada pela excessiva manipulação de tecidos, exigida em outros protocolos. Portanto, estamos agora mais bem preparados para transpor os estudos fundamentais desenvolvidos nesta investigação em produtos biotecnológicos na obtenção de cultivares superiores. Palavras-chave: Fatores de transcrição. Melhoramento moderno de plantas. Estresses ambientais. Senescência. Engenharia genética de plantas.