New Papiliotrema laurentii UFV-1 strains with improved acetic acid tolerance selected by adaptive laboratory evolution

Abstract

Depletion of fossil fuels and increase in greenhouse gas emissions have boosted the development of new technologies for biodiesel production. Oil extracted from soybeans is the major source for Brazilian biodiesel production (69.8%); nevertheless, its utilization as feedstock requires arable land, water, and nutrients that could be utilized for food crops and conversion to native vegetation. These drawbacks can be circumvented by using yeast oil for biodiesel production. The oleaginous yeast Papiliotrema laurentii can accumulate a high amount of lipids and metabolize lignocellulose-derived sugars. Due to the recalcitrant nature of lignocellulosic biomasses, a pretreatment step is required. Nevertheless, acid pretreatment, the most used in lignocellulosic biomasses, leads to the formation of toxic compounds that can inhibit yeast growth. Among them, acetic acid is the most abundant, and in its undissociated form diffuses through the cell membrane and dissociates in the cytosol, disrupting cell homeostasis. To circumvent the inhibitor effect, detoxification processes are applied to remove or reduce their concentrations. However, the detoxification strategies applied are usually insufficient to reduce the acetic acid concentration. For this, oleaginous yeasts capable of tolerating acetic acid are of interest. Recently, our research team isolated and characterized a P. laurentii able to achieve the highest lipid contents from xylose as the sole carbon source. Nevertheless, we observed in this work that its growth is severely impaired by acetic acid (1.0 g/L). Therefore, we applied Adaptive Laboratory Evolution (ALE) to select strains of P. laurentii UFV-1 tolerant to acetic acid. We selected and characterized three Acetic acid Tolerant Strains (ATS). All strains evolved displayed the tolerance phenotype (able to grow in the presence of 1.5 g/L of acetic acid) after 398 generations being exposed to increasing concentrations of acetic acid (0.7, 0.9, and 1.5 g/L). However, different phenotypes emerged alongside. Although the acetic acid tolerance presented by ATS II was, along with ATS I, the highest observed in this work, it displayed trade-offs in the absence of the acid. as its lipid productivity, biomass and specific growth rate decreased. ATS I and III showed physiological parameters similar to the parental strain (lipid and biomass production, and sugar uptake) in stress absence. However, the ATS III, in contrast to ATS I, did not display the oleaginousviii phenotype (<20% g lipids/ g DW) when challenged with 1.75 g/L of acetic acid. Therefore, ATS I was the most promising strain, showing tolerance to acetic acid and oleaginous phenotype in all conditions evaluated. Keywords: Yeast. Oleaginous. Inhibitors. Lignocellulosic biomass.

Novas linhagens de papiliotrema laurentii ufv-1 com maior tolerância ao ácido acético selecionadas por evolução adaptativa em laboratório. Orientador: Wendel Batista da Silveira. Coorientadora: Rafaela Zandonade Ventorim. A escassez de combustíveis fosseis e o aumento na emissão de gases do efeito estufa têm incentivado o desenvolvimento de novas tecnologias para a produção de biodiesel. O óleo de soja é a matéria-prima mais empregada na produção de biodiesel no Brasil (69,8%); no entanto, sua utilização requer terras cultiváveis, água e nutrientes que podem ser utilizados para culturas de alimentos ou reflorestamento. Esses problemas podem ser evitados a partir da utilização de óleos de leveduras para a produção de biodiesel. A levedura oleaginosa Papiliotrema laurentii pode acumular grandes quantidades de lipídios e metabolizar açúcares liberados de biomassas lignocelulósicas. Devido à natureza recalcitrante da biomassa lignocelulósica, uma etapa de pré-tratamento é aplicada. No entanto, o pré-tratamento ácido, o mais utilizado para esse tipo de biomassa, leva à formação de componentes tóxicos que podem inibir o crescimento de leveduras. Dentre eles, o ácido acético é o mais abundante, e na sua forma dissociada difunde pela membrana celular e se dissocia no citosol, comprometendo a homeostase celular. Para contornar esse efeito inibitório, processos de detoxificação são aplicados para remover ou reduzir a concentração desses compostos. Porém, as estratégias de detoxificação comumente aplicadas são insuficientes para reduzir a concentração de ácido acético. Sendo assim, a utilização de leveduras oleaginosas capazes de tolerar o ácido acético é de interesse em bioprocessos envolvendo o uso de hidrolisados hemicelulósicos. Recentemente, o nosso grupo de pesquisa isolou e caracterizou uma P. laurentii capaz de atingir altos conteúdos de lipídios a partir de xilose. No entanto, foi observado que seu crescimento é prejudicado pelo ácido acético. Neste estudo, a estratégia de Evolução Adaptativa em Laboratório foi utilizada para selecionar linhagens de P. laurentii UFV-1 tolerantes ao ácido acético. Todas as linhagens evoluídas (ATS – Acetic acid Tolerant Strains) apresentaram o fenótipo de tolerância, isto é, foram capazes de crescer na presença de 1,5 g/L de ácido acético após 398 gerações. Porém, diferentes fenótipos foram observados entre as três linhagens evoluídas. Embora a ATS II apresentou, junto com a ATS I, maior tolerância ao ácido acético, ela exibiu trade-offs na ausência do ácido porque a produtividade de lipídios, biomassa e velocidade específica de crescimento diminuíram. ATS I e III apresentaram parâmetros fisiológicos similares àqueles apresentados pela linhagem parental (produção de lipídios, biomassa e consumo de açúcares).x Apesar disso, ATS III, ao contrário da ATS I, não apresentou o fenótipo oleaginoso (< 20% g lipídios/ g massa seca) na presença de 1.75 g/L de ácido acético. Portanto, a ATS I foi considerada a mais promissora, apresentando tolerância ao ácido acético e o fenótipo oleaginoso em todas as condições avaliadas neste estudo. Palavras-chave: Leveduras. Oleaginosas. Inibidores. Biomassa lignocelulósica.