Enviromental dissemination of antimicrobial-resistants Staphylococcaceae and isolation and characterization of two novel broad-host-range bacteriophages for their control

Abstract

The increasing prevalence of antimicrobial resistance (AMR) among Staphylococcaceae has become a major threat to human, animal, and environmental health, highlighting the need for alternative antimicrobial strategies. This thesis investigated the environmental dissemination of antimicrobial-resistant Staphylococcus and Mammaliicoccus species and evaluated the therapeutic and biotechnological potential of bacteriophages targeting multidrug-resistant isolates within a One Health framework. Environmental samples collected from farm effluents, animal production systems, and community-associated environments were subjected to bacterial isolation, antimicrobial susceptibility testing, molecular characterization, genetic diversity analysis, biofilm assays, and bacteriophage isolation and characterization. A total of 119 Staphylococcaceae isolates representing 16 species were recovered, including several clinically relevant pathogens. Among these isolates, 55.5% were multidrug-resistant, 84.0% carried at least one antimicrobial resistance gene, and 15.9% harbored the mecA gene. Genotypically related strains were identified in both farm and community environments, demonstrating the environmental dissemination of potentially pathogenic bacteria and antimicrobial resistance. To explore alternative antimicrobial approaches, two novel lytic bacteriophages, CSF and pTJK, were isolated and comprehensively characterized. Phage CSF exhibited a broad host range, infecting multidrug-resistant Staphylococcus and Mammaliicoccus isolates representing nine species, efficiently inhibited bacterial growth and biofilm formation, remained stable under diverse environmental conditions, and possessed a 140 kb double-stranded DNA genome lacking antimicrobial resistance, virulence, and lysogeny-associated genes. Comparative genomic analyses demonstrated that CSF represents a novel bacteriophage belonging to a previously undescribed genus. Similarly, phage pTJK, one of the first bacteriophages reported to infect Mammaliicoccus lentus, infected multiple multidrug-resistant Staphylococcaceae species, significantly inhibited biofilm formation, disrupted established biofilms, and displayed synergistic interactions with gentamicin and erythromycin, reducing bacterial growth more effectively than either treatment alone. Genomic analysis revealed a 135.8 kb double-stranded DNA genome encoding 231 open reading frames, including multiple endolysins and depolymerases associated with antibiofilm activity, while no antimicrobial resistance or bacterial virulence genes were detected. Collectively, these findings demonstrate that environmental ecosystems constitute important reservoirs of antimicrobial-resistant Staphylococcaceae and highlight the discovery of two novel, safe, and broad-host-range bacteriophages with significant potential for phage therapy and other biotechnological applications to combat antimicrobial resistance. Keywords: Antimicrobial resistance; Bacteriophages; Phage therapy; Staphylococcus; Mammaliicoccus; Staphylococcaceae; OneHealth ; Biofilms; Environmental surveillance; BiotechnologyO aumento da prevalência da resistência aos antimicrobianos (RAM) entre membros da família Staphylococcaceae tornou-se uma importante ameaça à saúde humana, animal e ambiental, evidenciando a necessidade de estratégias antimicrobianas alternativas. Esta tese investigou a disseminação ambiental de espécies de Staphylococcus e Mammaliicoccus resistentes aos antimicrobianos e avaliou o potencial terapêutico e biotecnológico de bacteriófagos direcionados a isolados multirresistentes, sob a perspectiva da Saúde Única (One Health). Amostras ambientais coletadas de efluentes de propriedades rurais, sistemas de produção animal e ambientes associados à comunidade foram submetidas ao isolamento bacteriano, testes de suscetibilidade aos antimicrobianos, caracterização molecular, análise da diversidade genética, ensaios de formação de biofilme e isolamento e caracterização de bacteriófagos. Um total de 119 isolados de Staphylococcaceae, representando 16 espécies, foi recuperado, incluindo diversos patógenos de relevância clínica. Entre esses isolados, 55,5% eram multirresistentes, 84,0% apresentavam pelo menos um gene de resistência aos antimicrobianos e 15,9% possuíam o gene mecA. Foram identificadas cepas geneticamente relacionadas em ambientes rurais e comunitários, demonstrando a disseminação ambiental de bactérias potencialmente patogênicas e de genes de resistência aos antimicrobianos. Para explorar abordagens antimicrobianas alternativas, dois novos bacteriófagos líticos, CSF e pTJK, foram isolados e amplamente caracterizados. O fago CSF apresentou amplo espectro de hospedeiros, infectando isolados multirresistentes de Staphylococcus e Mammaliicoccus pertencentes a nove espécies, inibiu eficientemente o crescimento bacteriano e a formação de biofilmes, manteve-se estável sob diversas condições ambientais e apresentou um genoma de DNA de fita dupla de 140 kb, sem genes associados à resistência aos antimicrobianos, virulência ou lisogenia. Análises genômicas comparativas demonstraram que CSF representa um novo bacteriófago pertencente a um gênero ainda não descrito. Da mesma forma, o fago pTJK, um dos primeiros bacteriófagos relatados com capacidade de infectar Mammaliicoccus lentus, infectou múltiplas espécies de Staphylococcaceae multirresistentes, inibiu significativamente a formação de biofilmes, desestruturou biofilmes já estabelecidos e apresentou interações sinérgicas com gentamicina e eritromicina, reduzindo o crescimento bacteriano de forma mais eficaz do que cada tratamento isoladamente. A análise genômica revelou um genoma de DNA de fita dupla de 135,8 kb, contendo 231 fases abertas de leitura (ORFs), incluindo múltiplas endolisinas e despolimerases associadas à atividade antibiofilme, sem a detecção de genes de resistência aos antimicrobianos ou de virulência bacteriana. Em conjunto, esses resultados demonstram que os ecossistemas ambientais constituem importantes reservatórios de Staphylococcaceae resistentes aos antimicrobianos e destacam a descoberta de dois novos bacteriófagos seguros e com amplo espectro de hospedeiros, apresentando significativo potencial para aplicações em fagoterapia e outras aplicações biotecnológicas voltadas ao combate à resistência aos antimicrobianos. Palavras-chave: Antimicrobial resistance; Bacteriophages; Phage therapy; Staphylococcus; Mammalia; Staphylococcaceae; One Health; Biofilms; Environmental surveillance; Biotechnology