Efeito da metformina na competência oocitária bovina e viabilidade embrionária pós-criopreservação

Abstract

A metformina (MT), a qual atenua a liberação dos radicais livres, e a absorção e a condensação dos lipídios, pode melhorar os resultados da produção in vitro e a criotolerância de blastocistos. O presente trabalho objetivou avaliar o efeito de concentrações da MT entre 0,05 (MT1), 0,1 (MT>) e 0,2 (MTs) mM adicionadas durante a pré-maturação e a maturação in vitro-MIV nos experimentos (EXPs) 1 e 2,e o cultivo in vitro-CIV com renovação do meio (EXP3.1) (50% nos 3º e 6º dias de cultivo) ou sem renovação (EXP3.2). No EXP4, os oócitos maturaram e os zigotos desenvolveram com 0,1 e 0,05 mM MT nos grupos: MMTo+CMTo, MMTo+CMT+, MMT>+CMTo e MMT>+CMT:+, e o EXP5 comparou a criotolerância entre o controle e MMT>+CMT:. Os parâmetros avaliados nos blastocistos foram: o número de blastômeros apoptóticos e totais usando o ensaio de TUNEL (terminal deoxynucleotidyl transferase dUTP- digoxigenin nick end-labeling) e a coloração de DAPI (4'6-diamidino-2-phenylindole), respectivamente (EXP2, 3.2 e 5), a área ocupada pelos lipídios e a taxa da peroxidação no EXP4, utilizando a sonda de BODIPY*8!59C14 e a re-expansão e a eclosão pós-vitrificação no EXP5. O software utilizado para contar as células e medir a àrea lipídica e a intensidade da florescência foi ImageJ (1.54d; National Institutes of Health, Wisconsin, EUA). A regressão logística (desenvolvimento embrionário e a indice da apoptose), a análise da variância com teste das médias (contagem das células e a oxidação de lipídios) e Qui-quadrado (dados qualitativos) foram os métodos estatísticos utilizados para analisar os dados. Média+tEPM representou os resultados e a consideração da diferença significativa foi quando P<0,05. A MT não afeitou (P>0,05) a produção de blastocistos quando adicionada na pré-maturação induzida por 12 horas com 50 uM da butirolactona | (EXP1). No EXP2, a MIV com 0,1 mM MT apresentou as maiores taxa (P<0,05) de blastocisto expandido, número de células e índice da apoptose (27,5+1,8%, 173,77+7 e 33,95+3,7/6%, respectivamente) do que o controle (18,1+4,8%, 138,33+11,12 e 19,05+2,9/%, respectivamente). No EXP3.1,0,1 mM MT resultou em uma taxa maior (P<0,05) de blastocisto (34,6+4,9%) do que controle (12,2+1,4%). Porém, no EXP3.2, a concentração de 0,05 mM MT resultou na maior proporção (P<0,05) de blastocisto total (60,3+2,5%) entre os grupos e no controle houve menor índice da apoptose (24,5+2,5%) (P<0,05) do que nos grupos tratados com 0,1 mM (27,9+1,9%) e 0,05 mM (26,4+1,9%) e semelhante (P>0,05) ao 0,2 mM (22,9+2%). No EXP4, MT não alterou a área de lipídios, mas a oxidação lipídica foi menor (P<0,05) no MMT>+CMT: (48,/5+2,76%) do que nos MMTo+CMTo (55,99+1,92%) e MMT>+CMTo (57,47+2,35%) e similar (P>0,05) ao MMTo+CMT: (52,16+2,67%). No EXP5, não houve efeito (P>0,05) do tratamento na viabilidade embrionária, mas blastocistos produzidos do MMT>+CMT+ mostrou maior (P<0,05) taxa de eclosão (15,93+9,33%) do que no controle (6,54+1,58%) com 24 horas após a devitrificação. Em conclusão, a metformina contribuiu para proteger os lipídios embrionários contra os agentes oxidantes, o que reflete em criotolerância maior após a vitrificação. Contudo, os efeitos no desenvolvimento embrionário dependem da dose e podem ser influenciados pela metodologia de cultivo adotada.Metformin, which attenuates free radical liberation, and lipids uptake and condensation, can improve in vitro blastocyst production and cryotolerance outcomes. The present work aimed to evaluate the effect of MT concentrations among 0.05 (MT), 0.1 (MT>) e 0.2 (MTs) mM added during pre-maturation and in vitro maturation-IVM in experiments (EXPs) 1 and 2, and in vitro culture-CIV with renewing the media (EXP3.1) (50% on 3" and 6!" days of culture) or without renewing (EXP3.2). In EXP4, the oocyte matured and the zygotes developed with 0.1 and 0.05 mM MT in the groups: MMTo+CMTo, MMTo+CMT+, MMT>+CMTo and MMT>+CMT+, and EXP5 compared the cryotolerance between the control and MMT>+CMT:+. The evaluated parameters in blastocysts were: apoptotic and total blastomeres number using TUNEL assay (terminal deoxynucleotidyl transferase dUTP-digoxigenin nick end-labeling) and DAPI staining (4'6-diamidino-2-phenylindole), respectively (EXP2, 3.2 e 5), lipids occupied area and peroxidation rate in EXP4, utilzing BODIPY*"99C4 probe and post- vitrification re-expansion and hatching in EXP5. The utilized software to count the cells and measure lipid area and florescence intensity was ImageJ (1.54d; National Institutes of Health, Wisconsin, USA). Logistic regression (embryo development and apoptosis index), variance analysis with means test (cell count and lipids oxidation) and Chi-square (qualitative data) were the utilized statistical methods for analyzing the data. Meant+SEM represented the results and the consideration of significant difference was when P<0.05. MT did not affect (P>0.05) blastocyst production when added in pre-maturation induced for 12 h with 50 uM of butyrolactone | (EXP1). In EXP2, IVM with 0.1 mM MT presented the highest (P<0.05) expanded blastocyst rate, cell number and apoptosis index (27.5+1.8%, 173.77+/ e 33.95+3./0%, respectively) than control (18.1+4.8%, 138.33+11.12 e 19.05+2.97%, respectively). In EXP3.1, 0.1 mM MT resulted in a higher (P<0.05) blastocyst rate (34.0+4.9%) than control (12.2+1.4%). However, in EXP3.2, the concentration of 0.05 mM MT resulted in the higher (P<0.05) total blastocyst proportion (60.3+2.5%) among the groups and in the control there was lower apoptosis index (24.5+2.5%) (P<0.05) than treated groups with 0.1 mM (27.9+1.9%) and 0.05 mM (26.4+1.9%) and similar (P>0.05) to 0.2 mM (22.9+2%). In EXP4, MT did not alter lipids area, but lipid peroxidation was lower (P>0.05) in MMT>+CMT: (48.75+2.76%) than in MMTo+CMTo (55.99+1.92%) and MMT>+CMTo (57.47+2.35%) and similar (P>0.05) to MMTo+CMT:+ (52.16+2.67%). In EXP5, there was no effect (P>0.05) of the treatment on embryo viability, but blastocysts produced from MMT>+CMT1 showed higher (P<0.05) hatching rate (15.93+9.33%) than in control (6.54+1.58%) within 24 h post desvitrification. In conclusion, metformin contributed to protect embryo lipids against oxidant agents, which reflecis in higher cryotolerance aíter vitrification. Nevertheless, the effects in embryo development depend on the dose and can be influenced by the adapted culture methodology. Key-words: Antioxidant. Blastocyst. Peroxidation. Lipids. Vitrification.