O papel dual de AtbZIP60 e AtbZIP9 como moduladores das vias de estresse no retículo endoplasmático e estresse osmótico

Abstract

O desenvolvimento e adaptação de plantas a condições ambientais é altamente correlacionado com a regulação da expressão gênica. Sobre condições de estresse, eventos celulares são desencadeados no intuito de restabelecer a homeostase celular. Da mesma forma, a via de resposta a proteínas mal dobradas (UPR) é caracterizada como sendo um mecanismo celular citoprotetor essencial a respostas aos estresses bióticos e abióticos, os quais são capazes de alterar a homeostase do retículo endoplasmático (RE). Mediante qualquer perturbação no RE que cause acumulo de proteínas mal dobradas em sua porção luminal, os receptores acoplados ao RE são ativados e desencadeiam a sinalização da via UPR. Uma vez ativada, essa cascata de sinalização promove o aumento da expressão de genes relacionados com o dobramento e a degradação de proteínas. Entretanto, em condições de estresse prolongado, a resposta de defesa não é capaz de restaurar o equilíbrio, dessa forma, vias de morte celular programada (PCD) são ativadas. A via NRP/DCD (Asparagine- Rich Protein/Development and Cell Death), uma via de morte celular programada mediada por proteínas ricas em asparagina, é responsiva e conecta sinais de estresse no RE e estresse osmótico. Embora esta via seja conservada entre as espécies, o mecanismo molecular não é totalmente caracterizado, assim como seus componentes. Além de seu papel essencial na via UPR, a chaperona molecular BiP modula negativamente a via de morte celular mediada por proteínas NRP/DCD. Com intuito de elucidar o mecanismo molecular da referida via de resposta a estresses e seus moduladores, AtbZIP60 e AtbZIP9 foram os alvos de estudos deste trabalho. Bem caracterizada como uma proteína da via UPR, bZIP60 apresenta duas isoformas que, consequentemente, podem apresentar respostas alternativas em condições de estresse distintas. Ao contrário de bZIP60, bZIP9 é pouco caracterizado em relação a sua função molecular e suas interações na célula com outras moléculas. Portanto, nós investigamos como bZIP60 e bZIP9 são modulados sobre condições de estresse osmótico e no RE, assim como o papel desses fatores de transcrição (FT) na via de morte celular programada mediada por proteínas NRP/DCD. Nós avaliamos como esses genes respondem a tratamentos com PEG (polietilenoglicol) e TUN (tunicamicina) em plântulas Col-0 (Columbia) de Arabidopsis. Ambos os genes apresentaram um aumento de expressão em resposta a ambos os estresses. Os FT bZIP usualmente atuam como dímeros, homodímeros ou heterodímeros, dessa forma, nós avaliamos se bZIP9 interage com bZIP60 ou se é capaz de formar homodímero. Não foi possível realizar a abordagem de duplo-híbrido em leveduras devido a capacidade de auto-ativação de ambos os FT. Interessantemente, através do ensaio BiFC (complementação bimolecular de fluorescência) nós identificamos que bZIP9 pode formar homodímeros assim como interagir com bZIP60, sendo que, a interação foi intensificada quando as plantas foram tratadas com o indutor TUN. Devido a interação dos FT e o aumento de suas expressões em condições de estresse no RE e osmótico, nos perguntamos se essa expressão elevada em Arabidopsis poderia promover tolerância a estresse osmótico e no RE. Nós observamos uma resposta dual de bZIP9 e bZIP60 perante ambos os estresses. Linhagens superexpressando bZIP9 e bZIP60 foram mais tolerantes a condições de seca quando comparadas com Col-0 ou com a linhagem nocaute de bZIP60 (bzip60). Essas linhagens superexpressando os FT apresentaram fenótipo turgido, alto conteúdo relativo de água durante o estresse, assim como uma maior taxa de sobrevivência após a reidratação. Apesar disso, sobre condições prolongadas de estresse no RE, as mesmas linhagens apresentaram um fenótipo de clorose mais proeminente quando comparados com Col- 0 e bzip60. Além disso, nós avaliamos a influência dos FT na via de morte celular mediada por proteínas NRP desencadeada por estresse no RE. Linhagens superexpressando bZIP9 e bZIP60, Col-0 e bzip60 foram induzidas com TUN. A linhagem bzip60 não mostrou indução de NPR1, enquanto o gene NRP2 foi reprimido nessa condição. Entretanto, as linhagens superexpressando os FT mostraram um aumento na expressão de NRP1 quando comparado com Col-0 e bzip60. Nós também avaliamos a influência da superexpressão de NRP/DCD na expressão gênica de bZIP9 e bZIP60. Transformamos protoplastos com vetores carreando os genes NRPs e avaliamos a resposta após 8h de indução. A superexpressão de NRP1 e NRP2 estimulou positivamente a expressão dos FT. De acordo com tudo que foi mencionado, os resultados mostraram que bZIP9 e bZIP60 estão envolvidos em respostas a estresse osmótico e no RE, assim como modulam os genes NRP/DCD e são induzidos por eles. Experimentos adicionais são necessários para a compreensão do mecanismo desses FT em respostas a estresses.Plant development and adaptation to environmental conditions are highly correlated with the gene expression regulation. Upon stress conditions, cellular events are trigged in order to restore the cell homeostasis. Likewise, the unfolded protein response (UPR) is well characterized as an essential cytoprotective mechanism that responds to biotic and abiotic stresses, which alter the homeostasis of the endoplasmic reticulum (ER). Upon any disruption in the ER homeostasis that cause unfolded protein accumulation in the lumen, the ER-membrane attached receptors are activated and trigger the UPR signaling. Once activated, this signaling promotes the up regulation of synthesis, folding and protein degradation genes. Yet, upon prolongated stress conditions the defense response is not able to restore ER balance; therefore, activates the programmed cell death response (PCD). The NRP/DCD (Asparagine-Rich Protein/ Development and Cell Death)-mediated cell death response connects the signal from ER and osmotic stress. Although this pathway is conserved among species, the molecular mechanism it is not fully characterized, as well as the executors and modulators. Besides the essential role in the UPR pathway, the molecular chaperone BiP negatively modulates the NRP-mediated cell death response. In order to shed light on the molecular mechanisms of this stress response pathway and the unknown modulators, the AtbZIP60 and AtbZIP9 were the targets of this investigation. As a well characterized protein of the UPR response, bZIP60 shows two different isoforms in the cell, which can represent alternative responses upon distinct stress conditions. Unlike bZIP60, bZIP9 is poorly characterized in relation to the molecular function and the cellular partners in the cell. Therefore, we assessed how the bZIP60 and bZIP9 are modulated upon ER and osmotic stress conditions as well as the role of this transcription factors (TFs) in the NRP/DCD-mediated cell death response. The role of bZIP60 and bZIP9 in the drought and osmotic signaling is not fully understood, thus, we evaluate how those genes respond to PEG (polyethylene glycol) and TUN (tunicamycin) treatment in Arabidopsis Col-0 (Columbia) seedlings. Both genes were up regulated by either osmotic or ER stress. bZIP TFs usually perform as dimers, homodimers or heterodimers; thus, we tested whether bZIP9 can interact with bZIP60 or can form homodimer. We could not perform the yeast two-hybrid approach, once both genes present the self-activation in yeast system. Interestingly, by BiFC (Bimolecular Fluorescence Complementation) we identified that bZIP9 can form homodimer and interact with the bZIP60; moreover, the interaction is intensified when the plants were treated with ER stressor TUN. Because of the bZIP9 and bZIP60 interaction and their up regulation upon ER and osmotic stress, we asked whether the overexpression of those genes in Arabidopsis would promote tolerance to drought stress or extended ER stress. We observed a dual response of the bZIP9 and bZIP60 in response to drought stress and ER stress. bZIP9 and bZIP60 overexpressing lines were more tolerant to drought conditions compared to Col-0 or bzip60 knockout line. The overexpressing lines display a turgid phenotype, higher water relative content during the stress and higher survival rate after rehydration as compared to Col-0. Nevertheless, upon extended ER stress, the overexpressing lines presented more prominent chlorosis phenotype compared to Col-0 and bzip60. Moreover, we evaluated the influence of bZIP9 and bZIP60 on the NRP-mediated cell death response trigged by ER stress. bZIP9 and bZIP60 overexpressing lines, Col-0 and bzip60 knockout line were induced by TUN. bzip60 line did not show induction of NRP1, while NRP2 gene was repressed in that condition. However, the bZIP9 and bZIP60 overexpressing lines showed the up regulation of NRP1 when compared to Col-0 and bzip60. We also evaluated the influence of overexpression of NRP/DCD in the bZIP9 and bZIP60 gene expression. We transformed protoplast with vectors carrying NRPs genes and evaluated the response after 8h of induction. The overexpression of NRP1 and NRP2 up regulates bZIP9 and bZIP60 gene expression. Accordingly, the results showed that bZIP9 and bZIP60 are involved in ER and osmotic stress response, moreover, they modulate the NRP/DCD genes and are induced by them. Other experiments should be carried out to understand the mechanism of bZIP9 and bZIP60 in the stress responses.