Identificação e caracterização de uma poliuretanase com atividade lipolítica secretada por Serratia liquefaciens L135 isolada de leite cru

Abstract

Serratia liquefaciens é uma bactéria frequentemente encontrada no leite cru refrigerado e possui alto potencial de deterioração proteolítica. Neste trabalho, o potencial lipolítico de S. liquefaciens L135, isolada do leite cru refrigerado, foi avaliado e uma enzima lipolítica foi purificada e caracterizada. A atividade lipolítica de S. liquefaciens L135 foi verificada em diferentes temperaturas, sendo 30 °C a temperatura ótima de atividade da enzima. A termoestabilidade da enzima foi avaliada em leite desnatado reconstituído a 10% e o valor D encontrado nas temperaturas de 65, 72, 85 e 95 °C foi de, aproximadamente, 97, 66, 50 e 28 min, respectivamente. O valor Z da enzima foi de 60 °C e a simulação do tempo / temperatura de pasteurização lenta e rápida não resultou na inativação completa da atividade lipolítica. Além disso, esta enzima foi purificada 3,1 vezes com 21,5% de recuperação e apresentou, por zimografia, massa molecular de, aproximadamente, 65 kDa. A identificação por LC-MS/MS indicou tratar-se de uma poliuretanase, com massa molecular teórica de 64,864 kDa, confirmando a estimativa feita por zimografia, e pI teórico de 4,35. A poliuretanase homóloga identificada possui 615 resíduos de aminoácidos, sequência altamente conservada de lipase (GXSXG) que envolve a serina catalítica e é secretada pelo sistema de secreção do tipo I, chamado transportador ABC. In silico, a poliuretanase complexou-se com substratos de cadeia longa, média e curta, confirmando a atividade lipolítica. A poliuretanase exibiu atividade máxima em pH 8,0 e a 30 °C, foi estimulada na presença dos íons Ca 2+ e Ba2+ e inibida pelos íons Zn2+, Cu2+, Fe2+, Co2+, Ni2+ e Mn2+ na concentração final de 10 mM. Na presença de ditiotreitol (DTT), β-mercaptoetanol e dodecil sulfato de sódio (SDS), a atividade da enzima foi aumentada ou pouco influenciada. No entanto, na presença de Tween-80, Triton X-100 e de ácido etilenodiamino tetra-acético (EDTA), a atividade lipolítica foi inibida. Além disso, dietil pirocarbonato (DEPC) e fluoreto de fenilmetilsulfonil (PMSF), na concentração de 10 mM, inibiram completamente a atividade da poliuretanase, mostrando que os resíduos de serina e histidina são importantes para manter a conformação ativa. Este estudo é o primeiro que descreve que S. liquefaciens isolada do leite cru produz uma enzima lipolítica que apresenta estabilidade nas temperaturas de pasteurização, o que pode comprometer a qualidade do leite e seus derivados.Serratia liquefaciens is a bacterium frequently found in refrigerated raw milk and has a high potential for proteolytic deterioration. In this work, the lipolytic potential of S. liquefaciens L135, isolated from refrigerated raw milk, was evaluated and a lipolytic enzyme was purified and characterized. The lipolytic activity of S. liquefaciens L135 was verified at different temperatures, with 30 °C being the optimum temperature of enzyme activity. Thermostability of the enzyme was evaluated in 10% reconstituted skimmed milk and the D value found at temperatures of 65, 72, 85 and 95 °C was approximately 97, 66, 50 and 28 min, respectively. The Z-value of the enzyme was 60 °C and the slow and rapid pasteurization time / temperature simulation did not result in complete inactivation of lipolytic activity. In addition, this enzyme was purified 3.1 times with 21.5% recovery and presented, by zymography, molecular mass of approximately 65 kDa. Identification by LC-MS/MS indicated that it was a polyurethanase with a theoretical molecular weight of 64.864 kDa, confirming the estimate made by zymography, and theoretical pI of 4.35. The identified homologous polyurethanase has 615 aminoacid residues, highly conserved lipase sequence (GXSXG) which involves the catalytic serine and is secreted by the type I secretion system, called the ABC transporter. In silico, the polyurethanase complexes with medium and short chain long chain substrates, confirming the lipolytic activity. The polyurethanase showed maximum activity at pH 8.0 and at 30 ° C, was stimulated in the presence of Ca2+ and Ba2+ ions and inhibited by the Zn2+, Cu2+, Fe2+, Co2+, Ni2+, and Mn2+, ions at the final concentration of 10 mM. In the presence of dithiothreitol (DTT), β-mercaptoethanol and dodecyl sulfate sodium (SDS), the enzyme activity was increased or little influenced. However, in the presence of Tween-80, Triton X- 100 and ethylenediamine tetraacetic acid (EDTA), lipolytic activity was inhibited. In addition, diethyl pyrocarbonate (DEPC) and phenylmethylsulfonyl fluoride (PMSF), at the concentration of 10 mM, completely inhibited the activity of the polyurethanase, showing that serine and histidine residues are important to maintain the active conformation. This is the first study to describe that S. liquefaciens isolated from raw milk produces a lipolytic enzyme that shows stability at pasteurization temperatures, which may compromise the quality of milk and its derivatives.