Desenvolvimento de um meio de cultura para a levedura oleaginosa Papiliotrema laurentii combinando análise de balanço de fluxo e experimento fatorial

Abstract

A demanda global por oleoquímicos vem aumentando ao longo dos últimos anos. Atualmente, a maioria desses compostos é produzida a partir de óleos vegetais, no entanto, a obtenção de oleoquímicos a partir de biomassa vegetal enfrenta desafios ambientais e socioeconômicos, uma vez que compete com a produção de alimentos. Os óleos microbianos, surgem como uma alternativa sustentável aos óleos vegetais, uma vez que não competem com a produção de alimentos, não dependem de condições geográficas ou sazonais específicas e apresentam maior rendimento lipídico. Nesse sentido, as leveduras oleaginosas são consideradas plataformas promissoras pois conseguem sintetizar lipídios a partir de matérias-primas abundantes e de baixo custo. A levedura oleaginosa Papiliotrema laurentii demonstrou a capacidade de assimilar diversas fontes de carbono, contudo o seu crescimento é limitado em meios de cultura comumente utilizados para o cultivo de leveduras oleaginosas. Portanto, é necessário desenvolver um meio de cultura que promova seu crescimento e, consequentemente, uma maior produtividade de lipídios. A análise de balanço de fluxo (do inglês Flux Balance Analysis ou FBA), aplicada a modelos metabólicos em escala genômica (do inglês Genomic-scale Metabolic Models ou GEMs), tem sido empregada com sucesso para obter informações fisiológicas e explorar o potencial genético de microrganismos. Neste trabalho, a FBA foi empregada utilizando o GEM de P. laurentii (papla-GEM) para direcionar experimentos fatoriais com o objetivo de desenvolver um meio de cultura que favoreça o crescimento de P. laurentii. Com base na FBA, foram selecionadas quatro fontes de carbono (glicose, xilose, sacarose e lactose) e duas fontes de nitrogênio (sulfato de amônio e ureia). Foi então delineado um experimento fatorial 4x3x2, avaliando combinações entre as quatro fontes de carbono em três concentrações e as duas fontes de nitrogênio. A combinação de lactose e ureia resultou em uma maior produção de biomassa e título lipídico. Posteriormente, foi avaliado o efeito do aumento da concentração do extrato de levedura e da concentração de carbono em um experimento fatorial 4x3. A condição de cultivo baseada na combinação de 28,56 g L-1 de lactose, 0,234 g L-1 de ureia e 0,5 g L-1 de extrato de levedura, com uma razão C:N de 75:1, resultou em um aumento de 500% tanto na produção de biomassa, quanto no título lipídico em comparação com a condição padrão, representada pelo meio de cultivo SS2 contendo 30 g L-1 de glicose, 0,523 g L-1 de sulfato de amônio e 0,1 g L-1 de extrato de levedura. Esses resultados demonstram que a estratégia proposta foi eficaz para aumentar a produção de biomassa por P. laurentii e, consequentemente, de lipídios com potencial para produção de oleoquímicos.

Palavras-chave: Levedura Oleaginosa. Biomassa. Título lipídico. Lactose. Ureia.The global demand for oleochemicals has been increasing over the last years. Most of these compounds are currently produced from vegetable oils; however, obtaining oleochemicals from plant biomass is a great challenge from an environmental and a socio-economic point of view, as there is a competition with the food production. Microbial oils have emerged as a sustainable alternative to vegetable oils, as they do not compete with the food production, display higher lipid yields compared to vegetable oils, and their production does not rely on specific geographical or seasonal conditions. Oleaginous yeasts are considered sustainable platforms for oleochemical production as they can synthesize lipids from abundant and low-cost raw materials. The oleaginous yeast Papiliotrema laurentii is able to assimilate various carbon sources; however its growth yeast is limited in culture media generally used for cultivation of oleaginous yeasts. Therefore, it is necessary to develop a culture medium that favors its growth, in turn the production of highest lipid titers. Flux balance analysis (FBA) applied to genome-scale metabolic models (GEMs) has been a useful tool to gain insights regarding microbial physiology and explore the genetic potential of microorganisms. These models represent the metabolic pathways of an organism, enabling the design of factorial experiments. In this context, FBA was used in the papla-GEM model to guide factorial experiments aiming to develop a culture medium that favors the growth of P. laurentii. Based on FBA, four carbon sources (glucose, xylose, sucrose, and lactose) and two nitrogen sources (ammonium sulfate and urea) were selected. A 4x3x2 factorial experiment was then constructed, evaluating the four carbon sources at three concentrations in the two nitrogen sources. This experiment indicated that the combination of lactose and urea led to the highest increase in both biomass and lipid titer. Subsequently, the effect of increasing yeast extract concentration and carbon concentration was evaluated in a 4x3 factorial experiment. Increasing the yeast extract concentration up to 0.5 g L-1 led to an increase in both biomass and lipid titer production in P. laurentii. The cultivation condition based on the combination of 28.56 g L-1 lactose, 0.234 g L-1 urea, and 0.5 g L-1 yeast extract (C:N ratio of 75:1), increased by 500% both biomass production and lipid titer, compared to the reference condition (SS2 culture medium containing 30 g L-1 glucose, 0.523 g L-1 ammonium sulfate and 0.1 g L-1 yeast extract). These results indicate that the adopted strategy was suitable to increase the biomass production by P. laurentii.

Keywords: Oleaginous yeast. Biomass. Lipid yield. Lactose. Urea.