Bioprospecting of enzymes from fungi isolated from Canastra cheeses for industrial application

Abstract

The microbial diversity of Brazilian artisanal cheeses is far from being fully explored. Among frequently isolated microorganisms, bacteria and fungi stand out. Filamentous fungi can be highlighted for their significant impact in the quality of surface mould-ripened cheeses, besides that several metabolites produced, including enzymes. Fungal enzymes are widely used in industry, due to the easier extraction and purification compared to other enzymes sources. In this context, the aim of this study was to evaluate the proteolytic and lipolytic activity of 58 filamentous fungi isolated from artisanal cheeses produced in Canastra region, Minas Gerais State, Brazil. Submerged fermentation assays were performed considering casein as a protease inducer and olive oil as a lipase-inducing substrate. The proteolytic activity was evaluated by the caseinolytic method using a spectrophotometric assay; lipolytic activity, by potentiometric titration of fatty acids released by fungi lipases. Penicillium steckii and Aspergillus versicolor showed the highest proteolytic activity, with with 31.14 U/mL and 29.35 U/mL, respectively. Regarding lipolytic activity, Geotrichum candidum and Penicillium steckii presented the highest activities, with 62.91 U/mL and 55.44 U/mL, respectively. Considering the results of the proteolytic activity and their potential use in the dairy industry, a Geotrichum candidum isolate (GC-31) was selected and submitted to ultraviolet light (UV) mutation induction assay; then, the mutants obtained were evaluated for proteolytic activity. In total, 18 mutant strains were obtained; GC-M10 showed an increase in proteolytic activity up to 274% (29.96 U/mL) in comparison to the wild type (10.94 U/mL); therefore, the UV induction method was efficient in increasing the enzymatic activity of the isolated evaluated. This study showed that fungi isolated from artisanal cheeses produced in Canastra region have potential for biotechnological exploration and the production of industrial enzymes. Keywords: Protease.Lipase. Canastra cheese.Geotrichum candidum.Mutante.Epifluorescence microscopy.

Queijos artesanais brasileiros apresentam uma complexa microbiota, ainda longe de ser totalmente explorada. Dentre os microrganismos frequentementes isolados, destacam-se bactérias, leveduras e fungos filamentosos; estes últimos merecem destaque por impactarem significativamente na qualidade do produto, bem como por se constituírem de fonte importante de diversos metabólitos, principalmente enzimas. Enzimas fúngicas são amplamente utilizadas na indústria, pela facilidade de extração e purificação em relação a outras fontes. Nesse contexto, o objetivo deste estudo foi avaliar as atividades proteolítica e lipolítica de 58 isolados fúngicos coletados de queijos artesanais produzidos na região da Canastra, estado de Minas Gerais, Brasil. Ensaios de fermentação submersa foram realizados considerando-se a caseína como indutora de protease e o azeite de oliva como substrato indutor de lipase. A atividade proteolítica foi avaliada pelo método caseinolítico, por meio de ensaio espectofotométrico; a atividade lipolítica, por titulação potentiométrica de ácidos graxos liberados pela enzima. Penicillium steckii e Aspergillus versicolor demonstraram maior atividade proteolítica, com 31.14 U/mL e 29.35 U/mL, respectivamente. Em relação à atividade lipolítica, Geotrichum candidum e Penicillium steckii demonstraram maior atividade, com 62.91 U/mL e 55.44 U/mL, respectivamente. A partir dos resultados de atividade proteolítica, o isolado de G. candidum (GC-31) foi selecionado para ensaios de indução de mutação por luz ultravioleta (UV); os mutantes foram, então, avaliados quanto à atividade proteolítica. No total, 18 estirpes mutantes foram obtidas; GC-M10 demonstrou aumento na produção de proteases de 274% (29.96 U/mL) em comparação com a estirpe selvagem (10.94 U/ml). Portanto, o método de indução por UV mostrou-se eficiente no aumento da atividade enzimática de G. candidum. Este estudo demonstrou que fungos isolados de queijos artesanais produzidos na região da Canastra, bem como estirpes mutantes, apresentam potencial de exploração biotecnológica para produção de enzimas de interesse industrial. Palavras-chave: Protease. Lipase. Queijo Canastra. Geotrichum candidum. Mutante. Microscopia de epifluorescência.