Lacases de actinobatérias: caracterização, obtenção de novos primers e expressão heteróloga na levedura Kluyveromyces marxianus UFV-3

Abstract

Dentre as enzimas multicobre oxidases, as lacases, por sua grande variedade de substratos, tem atraído atenção tanto para pesquisa básica quanto aplicada a atividades industriais e ambientais. Com relação às lacases de origem microbiana, pouco se conhece sobre aquelas produzidas por bactérias. Neste trabalho, destaca-se o filo Actinobacteria, ordem Actinomycetales, devido à sua reconhecida importância biotecnológica e sua habilidade para degradação de compostos recalcitrantes, sendo muitos deles substratos de lacases. Tendo em vista a demanda por grande volume de enzima por parte das diversas indústrias, e a dificuldade de manipulação dos produtores nativos, é sugerida aqui a expressão heteróloga de lacases de actinobactérias na levedura Kluyveromyces marxianus, em virtude das propriedades industriais que a mesma apresenta, tais como alta velocidade do crescimento, termotolerância e status Generally Regarded as Safe (GRAS). O objetivo deste trabalho foi obter uma linhagem de Kluyveromyces marxianus portando gene de lacase de actinobactéria, capaz de expressá-lo e secretar a enzima ativa; buscando- se, para isso, isolar actinobactérias produtoras de lacase a partir de solo, caracterizar a enzima, isolar um gene de lacase, clonar em vetor de expressão e, por fim, transformar K. marxianus UFV-3. A partir de dados da literatura, realizou-se uma revisão crítica relacionada ao tema, e as sequências gênicas que codificam proteínas caracterizadas foram identificadas e utilizadas na síntese de oligonucleotídeos iniciadores que se revelaram adequados para detecção e isolamento do gene neste grupo, havendo distinção de genes correspondentes a proteínas com duas estruturas distintas. Havendo o isolamento de um dos genes, o mesmo foi clonado em cassete de expressão para integração no genoma da K. marxinus UFV-3; os dados sugerem que houve sucesso na integração.

The great diversity in substrate range oxidized by laccase enzymes has attracted attention in both areas of research: basic, and applied to industrial and environmental activities. Among microbial laccases, little is known about the ones produced by bacteria. In this work, it is highlighted the phylum Actinobacteria, order Actinomycetales, due to its recognized biotechnological importance and capacity of degrading recalcitrant compounds. Owing to the large amounts of enzyme required for industrial application, summed to the difficulty in manipulation of native producers, heterologous expression is here suggested using the yeast Kluyveromyces marxianus as host, which presents the industrial-relevant properties such as fast growth, thermotolerance and status generally regarded as safe (GRAS). The objective of this work was to obtain a strain of Kluyveromyces marxianus expressing and secreting a laccase from actinobacteria; and, in order to accomplish the main objective, we searched for isolating laccase-producing actinobacteria from soil, characterizing the enzyme, isolating a laccase gene, cloning into expression vector and, finally, transforming K. marxianus UFV-3. In this work, an isolation from soil samples provided laccase-producer colonies, having one of the selected been characterized. From literature data, a critical review was produced, and available gene sequences that codify characterized proteins were employed for designing oligonucleotide primers. The new primers proved to be effective for detection of laccase genes in actinobacteria, and, furthermore, allowed distinction of genes that corresponded to two structurally different laccases. After selection of a complete laccase gene, it was cloned into an expression cassette for integration into K. marxianus UFV-3 genome, and data suggest successful integration.