Avaliação da atividade de lisozima e despolimerases fágicas expressas heterologamente no controle de patógenos bacterianos associados à mastite bovina

Abstract

A mastite bovina permanece entre as principais enfermidades que afetam a bovinocultura leiteira, ocasionando prejuízos econômicos significativos e favorecendo o uso intensivo de antimicrobianos, o que contribui para a disseminação da resistência bacteriana. Nesse contexto, proteínas derivadas de bacteriófagos surgem como alternativas promissoras para o controle de patógenos associados à doença. O presente estudo teve como objetivo de realizar a expressão heteróloga e avaliar as atividades antibacteriana e antibiofilme de uma lisozima e duas despolimerases derivadas de bacteriófagos frente a isolados bacterianos associados à mastite bovina. As proteínas foram produzidas em Escherichia coli BL21(DE3), purificadas por cromatografia de afinidade e caracterizadas por análises in silico, SDS-PAGE e Western blot. A atividade biológica foi avaliada por ensaios de crescimento bacteriano, formação de biofilme e teste de gotejamento. As análises estruturais identificaram um domínio conservado de lisozima do tipo T4 na proteína do bacteriófago BigMira, enquanto a endossialidase ShigP1 apresentou um domínio de chaperona autocatalítica e a despolimerase BigMira não apresentou domínios conservados identificáveis. Entre as proteínas avaliadas, apenas a lisozima do bacteriófago BigMira teve sua expressão recombinante confirmada. Essa enzima promoveu redução significativa do crescimento de sete isolados de Streptococcus uberis, com reduções entre 13% a 31%. Em Streptococcus agalactiae inibiu significativamente a formação de biofilme em oito isolados, apresentando reduções entre 54% a 79% na concentração de 10 µg/mL, porém não houve redução significativa no crescimento em nenhum dos isolados testados. Já em Staphylococcus aureus não foi possível distinguir os efeitos da lisozima recombinante em relação ao tampão sobre a redução de crescimento dos isolados, enquanto que sobre o biofilme quatro isolados demonstraram redução significativa variando entre 20 % a 50 % de redução. Não foi observada atividade nos ensaios de gotejamento em nenhuma das espécies testadas. Os resultados demonstram que a lisozima recombinante derivada do bacteriófago BigMira apresenta potencial como agente antibacteriano e antibiofilme contra importantes patógenos da mastite bovina, constituindo uma estratégia promissora para o desenvolvimento de alternativas aos antimicrobianos convencionais.Palavras-chave: S. aureus; S. uberis ; S. agalactiae; RECOMBINANTES; ANTIBIOFILME; BACTERIÓFAGOS PROTEÍNAS.

Bovine mastitis remains among the main diseases affecting dairy cattle production, causing significant economic losses and encouraging the intensive use of antimicrobials, which contributes to the dissemination of bacterial resistance. In this context, bacteriophage-derived proteins emerge as promising alternatives for controlling pathogens associated with the disease. This study aimed to heterologously express and evaluate the antibacterial and antibiofilm activity of a lysozyme and two depolymerases derived from bacteriophages against bacterial isolates associated with bovine mastitis. The proteins were produced in Escherichia coli BL21(DE3), purified by affinity chromatography, and characterized by in silico analyses, SDS-PAGE, and Western blot. Biological activity was evaluated by bacterial growth assays, biofilm formation, and spot tests. Structural analyses identified a T4-like lysozyme conserved domain in the BigMira bacteriophage protein, whereas the ShigP1 endosialidase presented an autocatalytic chaperone domain, and the BigMira depolymerase showed no identifiable conserved domains. Among the evaluated proteins, only the recombinant lysozyme from bacteriophage BigMira had its expression confirmed. This enzyme significantly reduced the growth of seven Streptococcus uberis isolates, with reductions ranging from 13% to 31%. In Streptococcus agalactiae, it significantly inhibited biofilm formation in eight isolates, reducing biofilm biomass by 54% to 79% at a concentration of 10 µg/mL, however, no significant reduction in bacterial growth was observed in any of the isolates tested. In Staphylococcus aureus, it was not possible to distinguish the effects of the recombinant lysozyme from those of the buffer on bacterial growth reduction. However, in biofilm assays, four isolates showed significant reductions ranging from 20% to 50%. No activity was observed in the spot tests for any of the tested species. These results demonstrate that the recombinant lysozyme derived from bacteriophage BigMira has potential as an antibacterial and antibiofilm agent against important bovine mastitis pathogens, constituting a promising strategy for developing alternatives to conventional antimicrobials. Keywords: S. aureus; S. uberis; S. agalactiae; RECOMBINANT PROTEIN; BIOFILM PREVENT; BACTERIOPHAGE.