Purificação e identificação de proteína de Babesia bovis com atividade lectínica

Abstract

O presente estudo objetivou purificar e identificar uma proteína de merozoíto de B. bovis com atividade lectínica. Para tal, antígenos solúveis totais de merozoíto foram submetidos à cromatografia de afinidade em coluna de agarose fetuína imobilizada. A fração protéica adsorvida à resina e eluída com cloreto de sódio foi denominada Fetuin Binding Protein (FBP) B. bovis. A homogeneidade e a caracterização da FBP quanto à massa molecular foram avaliados por SDS-PAGE, que revelou uma banda protéica na altura de 27 kDa, a qual não apresentou glicosilações quando conjugada com Pro-Q Emerald 300 glycoprotein Stain. Para identificar a constituição da amostra, à banda correspondente à fração protéica foi recortado do gel, tratada quimicamente e teve seus aminoácidos internos sequenciados por Espectrometria de Massa. A análise da sequência evidenciou que o fragmento era referente à albumina sérica bovina de Bos taurus com relação massa carga (m/z) de 1567,726 no pico mais intenso e com um score de 62 e 98, 98% de confiabilidade. Uma fração da FBP-B. bovis foi ainda submetida a sequenciamento da região NH2-terminal por Degradação Automática de Edman, cuja análise no algoritmo BLAST, envolvendo todos os microorganismos, identificou a sequência como sendo parte de uma proteína putativa não caracterizada de Dappu pulex (pulga d água), com um E-value de 6,5, 90% de identidade, 90% de positividade e massa aproximada de 26,939 Kilodaltons. Considerando a mesma sequência, outra análise no BLAST, restrita aos organismos do filo apicomplexa, foi realizada tendo seus aminoácidos identificados dentro da sequência de uma proteína putativa de B. bovis conservada evolutivamente com um score total de 52,8, cobertura de 71% e E-value de 0,40. O fragmento protéico isolado foi ainda utilizado para imunizar camundongos BALB/c para a produção de anticorpos específicos que, após serem purificados por cromatografia de afinidade, foram titulados por Dot-Elisa e reconheceram a FBP-B. bovis até o título de 102.400. Desta forma, foi obtida uma proteína de merozoíto de B. bovis com atividade lectínica, com os aminoácidos internos pertencentes à proteína albumina sérica bovina e os aminoácidos da região NH2-terminal a uma proteína putativa de B. bovis que foi reconhecida por anticorpos específicos anti-FBP B. bovis. De acordo com os resultados apresentados, acredita-se que a proteína com atividade lectínica de merozoíto de B. bovis purificada possa ser um dos mediadores envolvidos na parasitemia dos eritrócitos. Em estudos futuros, se comprovada esta hipótese, ela pode abrir perspectivas para novos processos de intervenção terapêutica contra a Babesiose bovina e maior controle da doença.

The present study aimed to purify and identify merozoite protein of B. bovis with lectin activity. For such, total soluble merozoite antigens (Bb-STAg) were subjected to affinity chromatography on immobilized fetuin agarose column. The resin adsorbed protein, eluted with NaCl, was named Fetuin Binding Protein (FBP-B.bovis). The homogeneity and characterization of molecular weight of FBP were assessed by SDS-PAGE, that revealed the protein band of 27 kilodaltons which wasn t glycosylated when combined with Pro-Q Emerald 300 glycoprotein Stain. To identify the constituent of the sample, the protein spot was cut from the gel, chemically treated and had their internal amino acids sequenced by mass spectrometry. The sequence analysis showed that the fragment was related to the bovine serum albumin of Bos taurus with mass/charge of 1567.726 in the most intense peak with score of 62 and 98,98% confidence. The fraction of the FBP-B. bovis was also subjected to sequencing of the NH2-terminal region by Automatic Edman degradation analysis which analysis in the BLAST, involving all the microorganisms, identified the following as part of a putative protein uncharacterized of Dappu pulex (flea d 'water), with E-value of 6.5, 90% identity, 90% of positivity and mass about 26.939 kilodaltons. Considering the same sequence, other BLAST analysis restricted to organisms of Apicomplexa phylum was made, and their amino acid sequence was identify as putative protein of B. bovis evolutionarily conserved with total score of 52,8, covering 71% and E-value 0.40. The isolated protein fragment was also used to immunize BALB/c mice to produce of specific antibodies that after being purified by affinity chromatography were titrated by Dot-ELISA that results in recognition of FBP-B. bovis (title 102,400). That away, was possible to obtain a protein fraction of merozoite of B. bovis with lectin activity, with the internal amino acid belonging to the protein bovine albumin serum and amino acids of the NH2-terminal region belonging to a putative protein of B. bovis that was recognized by specific anti-FBP B. bovis. According to the results presented, we believe this protein fraction of merozoite of B. bovis with lectin activity purified can be one important mediators involved in erythrocyte parasitemia. In future studies, it is proven hypothesis, it may open perspectives for new processes for therapeutic intervention against bovine babesioses and greater control of the disease.