Controle de biofilmes multiespécies de Pseudomonas paracarnis e Listeria monocytogenes por bactérias láticas e por estratégias de higienização

Abstract

Biofilmes multiespécies formados em superfícies de processamento representam um desafio à segurança microbiológica na indústria de laticínios devido à coexistência de microrganismos deterioradores e patógenos, à estabilidade da matriz de substâncias poliméricas extracelulares (EPS) e ao potencial de contaminação cruzada. Esta dissertação investigou estratégias complementares para o controle de biofilmes formados por Pseudomonas paracarnis A006, Listeria monocytogenes ATCC 7644 e bactérias láticas (BAL) em aço inoxidável. Na primeira etapa, BAL W10, BAL W22, BAL W32 e BAL W42 foram selecionadas entre 14 estirpes avaliadas. P. paracarnis apresentou contagens entre 7,0 e 8,0 log UFC/cm² em todas as condições avaliadas, sem diferenças significativas (p = 0,1824). Em contraste, L. monocytogenes foi significativamente afetada pelas interações microbianas, apresentando média de 6,3 log UFC/cm² em monocultivo e 5,3 e 5,6 log UFC/cm² nos co-cultivos contendo BAL W32 e BAL W42, respectivamente, indicando exclusão competitiva. O biofilme formado por P. paracarnis, L. monocytogenes e BAL W22 foi selecionado para os ensaios subsequentes por apresentar maior estabilidade estrutural e reprodutibilidade. Na segunda etapa, avaliou-se a eficácia de protocolos de higienização baseados na associação entre detergentes e sanitizantes oxidantes. O biofilme controle apresentou contagens de 7,5, 6,1 e 6,5 log UFC/cm² para P. paracarnis, L. monocytogenes e BAL W22, respectivamente. Protocolos combinando limpeza e sanitização reduziram as contagens para valores inferiores ao limite de detecção da técnica de contagem em placas (2,55 log UFC/cm²). Entretanto, análises por microscopia eletrônica de varredura e microscopia confocal revelaram a permanência de células aderidas com membrana preservada, mesmo na ausência de crescimento detectável por cultivo. Os resultados demonstram que interações microbianas modulam a persistência de patógenos em biofilmes multiespécies e que a redução de células cultiváveis não garante a completa remoção celular nem a eliminação do risco de contaminação cruzada, reforçando a necessidade de estratégias integradas de controle e métodos complementares para avaliação da eficácia da higienização. Palavras-chave: biocontrole; segurança de alimentos contaminação cruzada; indústria de laticínios.

Multispecies biofilms formed on processing surfaces represent a challenge to microbiological safety in the dairy industry due to the coexistence of spoilage and pathogenic microorganisms, the stability provided by the extracellular polymeric substances (EPS) matrix, and their potential for cross-contamination. This dissertation investigated complementary strategies for controlling biofilms formed by Pseudomonas paracarnis A006, Listeria monocytogenes ATCC 7644, and lactic acid bacteria (LAB) on stainless steel surfaces. In the first stage, the ability of LAB to modulate multispecies biofilm formation was evaluated. Among the 15 strains screened, LAB W10, LAB W22, LAB W32, and LAB W42 were selected. P. paracarnis maintained adhered cell counts between 7.0 and 8.0 log CFU/cm² under all conditions evaluated, with no significant differences among treatments (p = 0.1824). In contrast, L. monocytogenes was significantly affected by microbial interactions, exhibiting an average of 6.3 log CFU/cm² in monoculture and 5.3 and 5.6 log CFU/cm² in triple-species biofilms containing LAB W32 and LAB W42, respectively, indicating competitive exclusion. The biofilm composed of P. paracarnis, L. monocytogenes, and LAB W22 was selected for subsequent experiments due to its greater structural stability and reproducibility. In the second stage, the effectiveness of cleaning and sanitation protocols based on the combination of conventional or enzymatic detergents with oxidative sanitizers was evaluated. Untreated biofilms presented counts of 7.5, 6.1, and 6.5 log CFU/cm² for P. paracarnis, L. monocytogenes, and LAB W22, respectively. Combined cleaning and sanitation protocols reduced adhered populations to levels below the detection limit of plate counting (2.55 log CFU/cm²). However, scanning electron microscopy and confocal laser scanning microscopy analyses revealed the persistence of adhered cells with preserved membrane integrity, even in the absence of detectable growth by culture-based methods. These findings demonstrate that microbial interactions differentially influence pathogen persistence in multispecies biofilms and that reductions in culturable cells do not necessarily ensure complete biofilm removal or elimination of cross-contamination risks, highlighting the need for integrated control strategies and complementary methods to accurately assess sanitation efficacy in dairy processing environments. Keywords: biocontrol; cross-contamination; dairy industry; food safety.