Improved procedures to assess plant protoplast viability: evidencing cytological and genomic damages

Abstract

Plant protoplasts are valuable in biotechnology, enabling the plantlet regeneration until the gene function determination. In all applications, viability test is required to measure the rate of viable protoplasts, allowing to decide on the most adequate isolation and purification procedures and to verify whether there are sufficient cells for subsequent steps. Fluorescence microscopy is usually employed for viability test. However, some problems have been pointed out: long time required to count a relatively small number of protoplasts, cell clumps preventing their observation, and the subjective visual perception of the fluorescence by observer. This study aimed to establish procedures for viability test adapted for flow cytometry (FCM), MuseTM cell analyzer (Muse) and Comet Assay (CA). For this, Capsicum annuum was chosen due to recalcitrant morphogenic nature of its protoplasts. After isolation and purification, the applications allowed assessing large numbers of protoplasts (FCM and MUSE) and protoplasts nuclei (CA) in a short time period. From the adjusted procedures, different types and levels of cytological (FCM and Muse) and genomic damages (Muse and CA) were evidenced, allowing to discriminate and measure the viable protoplasts. Considering the results, this study introduces improved quantitative procedures for viability test. Besides of these and aiming the plantlet regeneration, different methods can be applied to assess the protoplast viability, defining the more adequate isolation and purification procedures. Contributing with this purpose, guides were showed for FCM, Muse and CA to standardization of viability tests in plant protoplastsEm todas as aplicações, o teste de viabilidade e necessario para medir a taxa de protoplastos viáveis, possibiltando decidir os procedimentos de isolamento e purificação mais adequados e verificar se ha celulas suficientes para as etapas subsequentes. A microscopia de fluorescência geralmente é empregada para o teste de viabilidade. No entanto, alguns problemas têm sido apontados: longo tempo necessário para contar um número relativamente pequeno de protoplastos, aglomerados de células que impedem a observação dos protoplastos e percepção visual da fluorescência subjetiva ao observador. Este estudo teve como objetivo estabelecer procedimentos para teste de viabilidade adaptado para citometria de fluxo (FCM), MuseTM cell analyzer (Muse) e Ensaio cometa (CA). Para isso, Capsicum annuum foi escolhido devido a natureza morfogênica recalcitrante dos protoplastos. Após o isolamento e a purificação, as aplicações permitiram avaliar um grande número de protoplastos (FCM e MUSE) e núcleos dos protoplastos (CA) em um curto período de tempo. A partir das adaptações nos procedimentos, foram evidenciados diferentes tipos e níveis de danos citológicos (FCM e Muse) e genômicos (Muse e CA), possibilitando discriminar e mensurar os protoplastos viãveis. Considerando os resultados, este estudo introduz procedimentos quantitativos melhorados para o teste de viabilidade. Alem disso, visando a regeneração de plântulas, diferentes métodos podem ser aplicados para avaliar a viabilidade de protoplastos, definindo os procedimentos de isolamento e purificação mais adequados. Corraborando para este propósito, foram mostrados guias para FCM, Muse e CA visando a padronizaçao dos testes de viabilidade em protoplastos de plantas.