Metabolismo protéico e energético e estudo ultra-estrutural da glândula mamária de cabras lactantes de diferentes genótipos para alpha s1-caseína

Abstract

Considerando a hipótese de que variações no gene da αs1-caseína possam afetar o metabolismo protéico e energético em cabras lactantes, e em conseqüência suas exigências nutricionais, uma série de três experimentos foi elaborada para analisar esta possibilidade, avaliando-se o desempenho animal, a eficiência de uso da proteína e da energia, a composição de caseínas e ácidos graxos, e a morfologia da glândula mamaria. No primeiro experimento avaliou-se o desempenho como também as eficiências de utilização de energia e do nitrogênio para a síntese de leite, de cabras com os genótipos AA, EE, EF e AF para αs1-caseína e alimentadas com dietas apresentando concentrações de 14% e 17% de proteína bruta. Para a determinação da eficiência de utilização de nutrientes utilizou-se um ensaio de digestibilidade com coleta total de fezes, alem de coletas totais de urina e leite. A interação entre os níveis de proteína da dieta e os genótipos para αs1-caseína não se apresentou significativa (P>0,05) para todas as variáveis avaliadas neste experimento. Animais pertencentes ao genótipo AA apresentaram valores de consumos de matéria seca, energia líquida, energia metabolizável e o balanço energético superiores aos dos animais do genótipo AF. Não se observou diferenças, entre os genótipos estudados, nos valores de eficiência bruta e líquida de utilização da energia metabolizável, sendo estes valores médios de 66,21 e 30,66%, respectivamente. O balanço de nitrogênio apresentou-se superior nos animais que consumiram a dieta com 17% de PB e a eficiência de utilização maior para a dieta com 14%. A maior excreção de nitrogênio na urina (NUEx), os maiores teores de nitrogênio uréico no plasma e a menor eficiência líquida de utilização da proteína metabolizável nos animais consumindo a dieta com 17% de proteína bruta fornecem indícios de que este teor protéico encontra-se acima das exigências de proteína das cabras lactantes deste experimento. Não foram observados efeitos significativos dos genótipos analisados e dos níveis de proteína na dieta sobre a produção diária de leite e os conteúdos de gordura, lactose e extrato seco total e de energia no leite. O segundo experimento foi conduzido com o objetivo de avaliar os efeitos dos genótipos para αs1-caseína do leite sobre a composição e o perfil de caseínas e de ácidos graxos no leite de cabras foram utilizadas cabras com os genótipos AA, EE, EF e AF para αs1-caseína e submetidas aos teores de 14% e 17% de proteína bruta na dieta. A composição do leite foi determinada utilizando-se espectrofotometria por radiação infravermelha, o perfil de caseínas por cromatografia líquida e o perfil de ácidos graxos por cromatografia gasosa. Para todas as variáveis avaliadas neste experimento não foram observados efeitos significativos (P>0,05) da interação entre os níveis de proteína da dieta e os genótipos para αs1-caseína. A concentração relativa de αs1-caseína nos animais contendo alelos homozigotos de alta expressão de αs1-caseína (AA) e nos heterozigotos (AF) apresentou-se como 24,88 e 21,80%, respectivamente, sendo superior aos dos animais dos demais genótipos. Os teores de proteína bruta do leite apresentados pelos animais do genótipo AA (31,68 g/L) foram significativamente superiores apenas aos dos animais do genótipo EF (29,01 g/L), embora não tenha diferido estatisticamente dos valores apresentados nos animais dos genótipos EE (29,94 g/L) e AF (30,24 g/L). A concentração de proteína verdadeira do leite (g.L-1) foi superior para os animais de genótipo AA quando comparada à dos animais dos genótipos EE e EF, em respectivamente, 5,5% e 9,3%. Nos genótipos homozigotos AA e EE observaram-se os níveis de expressão de αs1-caseína de 6,10 e 3,60g/L de leite, podendo-se inferir que a expressão por alelo, nestes casos, foi de respectivamente 3,05 e 1,8g/L de leite. Os animais do genótipo AA apresentaram os menores teores de κ−caseína e este fato associado a um maior conteúdo de αs1-caseína pode estar relacionado ao maior rendimento industrial atribuído ao leite dos animais deste genótipo. Não foram observados efeitos dos teores de proteína bruta da dieta sobre o porcentual de proteína verdadeira, proteína bruta e caseínas totais e individuais no leite. O perfil médio dos ácidos graxos no leite das cabras, os teores totais de ácidos graxos saturados e insaturados, mono e poliinsaturados não apresentaram efeitos significativos dos genótipos analisados e das concentrações de proteína na dieta. Apenas os ácidos graxos C6:0, C8:0 e C17:0 apresentaram-se em maiores concentrações nos animais recebendo a dieta com 14% de proteína bruta. O terceiro experimento foi conduzido com o objetivo de verificar os efeitos dos diferentes genótipos para αs1-caseína (AA, EE, EF e FF) quando analisados parâmetros relativos à morfologia do parênquima mamário e das células secretoras do leite de cabras adultas e em lactação. As análises foram realizadas a partir de biópsias teciduais e os critérios morfológicos basearam-se na descrição histológica e ultra-estrutural (microscopia eletrônica de transmissão). O parênquima da glândula mamária apresentou um padrão de organização geral único e independente dos genótipos para αs1-caseína. O parênquima mostrou-se formado por alvéolos, os quais são compostos por um epitélio com células secretoras colunares, células indiferenciadas e células mioepiteliais. No espaço interlobular observou-se a presença de um estroma constituído de tecido conjuntivo tendendo a frouxo, vasos sanguíneos, plasmócitos e mastócitos. No lúmen alveolar observou-se a presença de secreção láctea com células de descamação e polimorfonucleares. As células indiferenciadas do epitélio secretor não se estendem até a superfície luminal e apresentaram pleomorfismo quanto ao tamanho e a forma e também poucas organelas; no entanto apesar de exibirem polimorfismo nuclear, a cromatina do núcleo das células maiores mostrou-se mais eucromática que aquela observada nas células menores. A ultra-estrutura das células epiteliais secretoras no genótipo AA revelou um citoplasma quase que totalmente preenchido por retículo endoplasmático rugoso, cisternas e vesículas do aparelho de Golgi, além de numerosas mitocôndrias. As características citoplasmáticas das células secretoras dos genótipos EE e EF mostraram-se diferentes daquelas observadas no genótipo AA, por apresentarem a luz do retículo endoplasmático rugoso e das cisternas do Golgi muito dilatadas. A ultraestrutura das células secretoras do genótipo AF mostrou um padrão intermediário de dilatação da luz do reticulo endoplasmático rugoso e das cisternas e vesículas do aparelho de Golgi.

Taking into consideration the hypothesis that variations in genotypes for αs1-casein in milk may interfere on both efficiency of use and partitioning of nutrients for dairy goats and as a consequence on its nutritional requirements, a series of three experiments was conducted to evaluate animal performance, the energy and nitrogen efficiency and partitioning to milk synthesis, milk composition and mammary gland morphology. In the first experiment both animal performance and the efficiency of energy and nitrogen use for milk synthesis were evaluated by using goats of different genotypes named AA, EE, EF and AF for the αs1-casein and fed diets of 14 and 17% CP. A digestibility assay and total collection of urine and milk was performed to determine use and partitioning of energy and protein. No significant effect (P>0.05) was observed for the interaction level of protein and genotype to all variables tested. Higher values of intake of dry matter, of available energy and also for energy balance were observed for animals carrying the AA genotype as compared to those carrying the AF genotype. Efficiency of use of available energy was similar among genotypes averaging 66.21 and 30.66% for net and gross efficiency for ME respectively. Nitrogen balance presented superior for goats fed diets with 17% CP whereas higher efficiency of use of nitrogen was obtained for those receiving rations with 14% CP. The higher values of nitrogen excreted in urine, expressed as exogenous urinary nitrogen (ExoUN), of the plasma urea and lower net efficiency for using metabolizable (MP) observed for animals fed diets with 17% CP leads to suggests that the amount of protein used was over protein requirement for lactation. A second experiment was conducted to evaluate the effect of genotype for αs1-caseín on milk composition and profile of both casein and fatty acids by using goats of different genotypes named AA, EE, EF and AF for the αs1-casein when fed diets with 14 and 17% CP. Milk composition was determined by using infrared spectroscopy, the casein profile by liquid chromatography and fatty acids profile by gas chromatography. No significant effect (P>0.05) was observed as the interaction level of protein and genotype was tested for the independent variables studied. The relative concentrations of αs1-casein in animals carrying both homozygous alleles of high expression (AA) and for those heterozygous for high and low expression (AF) were of 24.88 and 21.80%, respectively, and considered higher as compared to EE and EF genotypes. Porcentage of milk protein for animals of the AA (31.68 g/L) genotype was higher as compared to those with the EF (29.01 g/L) genotype but similar to goats carrying the EE (29.94 g/L) and AF (30.24 g/L) genotype. Concentration of true protein was higher for the AA animals as compared to those carrying the EE and EF genotype by 5.5 and 9.3%, respectively. For animals of homozygous genotypes, named AA and EE, levels of αs1- casein expression were 6.10 and 3.60 g/L of milk, respectively, which leads to assume that the expression per allele in both cases were of 3.05 and 1.8 g/L of milk. Goats of AA genotype presented the lower levels of k-casein and that fact associated with a higher concentration of αs1-casein may be related to the higher industrial output attributed to the milk from animals of that genotype. No difference was found as levels of protein on diet were compared for milk protein porcentage and total casein concentration. Milk fatty acids profile, the ratio of saturated and unsaturated fatty acids concentration and mono and polyunsaturated fatty acids were similar as both main effects of genotypes and level of protein were studied but concentration of C6:0, C8:0, and C17:0 were higher for animals fed diet with 14% CP. Taking into consideration the hypothesis that genotypes for αs1- casein in milk may interfere on cell organelles involved with milk synthesis in goats a third experiment objected to evaluate and describe mammary parenchyma morphology in lactating goats of different genotypes named AA, EE, EF and AF for the αs1-casein when fed diets with 14 and 17% CP. Evaluation was carried out by tissue biopsy and histological analysis and ultra structure (electronic and transmission microscopy). A unique general pattern of organization was presented in both histological and ultra structural analysis of parenchyma. Despite the genotype for αs1-casein, parenchyma was comprised of alveolar lobules, compounded by columnar epithelial secretory cells, undifferentiated cells, and mioepithelial cells. For the interlobular space it was observed the presence of conjunctive stroma, blood vessels of specialized cells such as plasmocytes and mastocytes and in the alveolar lumen the presence of lacteal secretion, desquamation cells and polymorphonuclears. The undifferentiated cells into the mammary gland parenchyma presented pleomorphism concerning size and shape, little cytological differentiation of cytoplasm and the presence of polymorphic nucleus, with different pattern of condensation of chromatin, which tended to be more decondensed or euchromatic for larger cells and more condensed and heterochromatic for the smaller ones. The ultra structure of epithelial cells of mammary gland in animals carrying the genotype AA reveled cytoplasm comprised mostly by roughly endoplasmic reticulum and typical vesicles of Golgi apparatus in addition of numerous mitochondria. Conversely, cells in animals carrying the genotype EE, and EF presented dilations of vesicles of endoplasmic reticulum and Golgi cisterns. The ultra structure of epithelial cells of mammary gland in animals of goats carrying the genotype AF showed a pattern of vesicles fairly expanded, intermediary of those presented in both AA and EE/EF genotypes.