Vitrificação de folículos ovarianos pré-antrais de fêmeas bovinas com dimetilsulfóxido e sacarose acrescida de α-tocoferol

Abstract

Objetivou-se realizar a vitrificação de folículos ovarianos pré-antrais (FOPA) de fêmeas bovinas com dimetilsulfóxido (DMSO) e sacarose (SAC) acrescida de α-tocoferol (TOC), avaliando a morfologia de FOPA in situ e a viabilidade de FOPA isolados pós-vitrificação. O estudo foi realizado no Laboratório de Reprodução Animal do Departamento de Zootecnia da Universidade Federal de Viçosa. Foram utilizados ovários coletados de fêmeas bovinas abatidas, sem raça e idade definidas e em diferentes fases do ciclo estral. As variáveis qualitativas relacionadas à morfologia e viabilidade do FOPA foram submetidas ao teste não-paramétrico de Kruskal-wallis e teste de qui-quadrado respectivamente, a 5 % de probabilidade. No primeiro experimento utilizou-se 66 ovários de fêmeas bovinas, foram feitos cortes de 5 mm3 aproximadamente. Os fragmentos foram distribuídos aleatoriamente em nove tratamentos, representados pelo controle (fixado a fresco) e quatro soluções de vitrificação (SV) com dois tipos de descongelamento cada, representados da seguinte maneira: SV1m: DMSO, com descongelamento em meio essencial mínimo (MEM); SV1s: DMSO, com descongelamento em SAC; SV2m: DMSO + SAC, com descongelamento em MEM; SV2s: DMSO + SAC, com descongelamento em SAC; SV3m: DMSO + SAC + TOC 5 mM, com descongelamento em MEM; SV3s: DMSO + SAC + TOC 5 mM, com descongelamento em SAC e SV4m: DMSO + SAC + TOC 10 mM, com descongelamento em MEM; SV4s: DMSO + SAC + TOC 10 Mm, com descongelamento em SAC. Cada corte, após o descongelamento, foi fixado para histologia clássica e corado com eosina e hematoxilina sendo observado ao microscópio óptico em aumento de 400x. Analisou-se 13.500 FOPA, encontrando-se 6,238 primordiais, 6,812 primários e 450 secundários, e classificados em: bom, regular ou ruim. Concluiu-se que o DMSO, SAC e TOC podem ser utilizados na criopreservação de FOPA de fêmeas bovinas, recomendando-se trabalhar com DMSO, SAC e TOC 10 mM com descongelamento em MEM, e DMSO com SAC descongelado tanto com MEM quanto com SAC para criopreservar o FOPA in situ. No segundo experimento, foram utilizados 51 ovários de fêmeas bovinas, os cortes, tratamentos, criopreservação e descongelamento como descrito no primeiro experimento. Após o descongelamento, os fragmentos foram dissociados mecanicamente com meio de manutenção M199 e 5 % de albumina sérica bovina para filtração e posterior obtenção de FOPA isolados. A viabilidade dos FOPA foi examinada com azul de Trypan, mortos e vivos, corados ou não-corados, respectivamente, e observados ao microscópio invertido em aumento de 400x. Analisou-se 1500 FOPA isolados por tratamento, e um total de 13.500 folículos foram observados. Os resultados mostraram que o controle, ou seja, FOPA isolados sem vitrificação, diferiram de todos os tratamentos de criopreservação, mostrando assim que a criopreservação prejudica a viabilidade dos FOPA isolados. Porém, entre os tratamentos de vitrificação, o DMSO, SAC e TOC 10 mM, independentemente do tipo de descongelamento, mostraram os melhores resultados de viabilidade pós-criopreservação.

The objective of the study was to vitrify the ovarian pré-antral follicles (PF) of cows with dimethylsulfoxide (DMSO) and sucrose (SAC) plus α-tocopherol (TOC), by evaluation of the morphology of PF in situ and viability of post-vitrification isolated PF The study was conducted in the Laboratory of Animal scíence, University Federal of Viçosa. Ovaries were collected from slaughtered cows, with indefined breed and age at different stages of the estrous cycle. Qualitative variables related to viability and morphology of the PF were analised by non parametric test Kruskal-wallis and chi-square, respectively, at 5% probability. In the first experiment 66 ovaries of bovine females were used, fragments were cut with 5 mm3 approximately. Fragments were randomly assigned to nine treatments, represented by control (fixed in fresh) and four vitrification solutions (VS) with two thawing types each, represented as follows: SV1m: DMSO, with thawing in minimum essential medium (MEM); SV1s:DMSO, with thawing in SAC; SV2m: DMSO + SAC, with thawing in MEM; SV2s: DMSO + SAC, with thawing in SAC; SV3m: DMSO + SAC + TOC 5 mM, with thawing in MEM; SV3s: DMSO + SAC + TOC 5 mM, with thawing in SAC; SV4m: DMSO + SAC + TOC 10 mM, with thawing in MEM; SV4s: DMSO + SAC + TOC 10 Mm, with thawing in SAC. Each cut, after thawing, was fixed for classical histology and stained with hematoxylin and eosin and observed under 400x optical microscope. Thirteen thousand and five hundred (13,500) PF were analyzed, 6,238 primordial, 6,812 primary and 450 secondary, which were classified as good, regular and bad. It was concluded that DMSO, SAC and TOC may be used in the cryopreservation of bovine females PF. It is recommended to work with DMSO, SAC and 10 TOC mM thawed in MEM and DMSO and SAC thawed in MEM or SAC for PF cryopreservation. The second experiment 51 ovaries of cows were used, been cut, treated, cryopreserved and thawed as described in the first experiment. After thawing, the fragments were mechanically dissociated using maintenance M199 medium and 5% bovine serum albumin in order to, filtrate and subsequently isolates the PF.The viability of PF was examined with trypan blue, dead and alive stained or unstained respectively, and observed under inverted microscope with increase 400X. Fiftteen hundred (1,500) isolated PF were analyzed per treatment, with a total of 13,500 observed. The Results showed that the control, ie, PF without vitrification, differed from all of cryopreserved treatments, thus showing that cryopreservation affect the viability of isolated PF. However, the treatments of vitrification with DMSO, SAC and TOC 10 mM, irrespective of the thawing procedure, showed the best results of viability after cryopreservation.